粗糠柴毒素對SD大鼠抗心肌缺血-再灌注損傷的作用

李鴻博 郎小娥

(北京協和醫學院，北京 100005)

及時開通梗死相關動脈恢復心肌血流灌注，挽救瀕死心肌是治療急性心肌梗死最有效最關鍵的措施。然而缺血心肌的再灌注(I/R)可引起心肌I/R損傷(MIRI)。隨著心臟外科手術和介入治療技術的進展以及心肌缺血病人的增加，MIRI已成為臨床上常見的一種病理生理過程。隨著研究的深入，缺血預處理、麻醉預處理等一系列心肌保護措施已被發現〔1～3〕，且已被證明可以有效地對抗MIRI。心臟保護的機制較為復雜，其中乙醛脫氫酶2(ALDH2)的磷酸化與激活被證明在心臟保護中起關鍵介導作用〔4〕。另外，有研究發現在再灌注初期蛋白激酶Cδ(PKCδ)活化可通過調控線粒體介導細胞的凋亡和壞死，抑制PKCδ則會減輕I/R的各項損傷指標〔5〕。粗糠柴毒素是從植物粗糠柴中提取出的一種小分子物質〔6〕。Gschwendt等〔7〕首次報道粗糠柴毒素是一種PKCδ的選擇性抑制劑后，大量實驗研究以施用粗糠柴毒素作為抑制PKCδ活性的藥理學手段。另一方面，關于粗糠柴毒素的潛在藥物用途的研究也有報道，但就其對抗MIRI的效果卻研究較少。本研究通過構建大鼠在體心肌I/R模型并觀察粗糠柴毒素的處理效果來闡明粗糠柴毒素的心臟保護作用。

1 材料和方法

1.1實驗動物 選取雄性SD大鼠，體重200～220 g。由清華大學實驗動物中心提供。安置于無特殊病原體、溫度(23℃±3℃)和濕度(60%±5%)的控制室內，光暗周期為12 h：12 h(光照早上8點開始)。飲用水和標準飼料均經滅菌后供動物自由取用。

1.2急性心肌I/R模型制備 給予實驗SD雄性大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，氣管切開術后，大鼠肺組織進行機械正壓通氣，使用30%～40%的空氣/氧氣混合物，通過調整呼吸頻率和潮氣量，在整個實驗中維持動脈血氣pH值在生理范圍內。心肌梗死是由結扎冠狀動脈左前降支(LAD)引起。在大鼠胸骨左緣第4或第5肋間隙開胸，實施胸廓切開術及心包切開術后，暴露心臟，在距LAD基部2～3 mm處用6～0無創傷性絲線進行結扎，通過結扎LAD造成心肌梗死即可建立大鼠急性心肌缺血模型。剪斷結扎線心肌復灌。對所有大鼠進行區域性心肌缺血40 min，之后進行120 min再灌注處理〔8〕。將大鼠隨機分為兩組，各8只：實驗組在缺血處理前5 min給予1 μmol/L粗糠柴毒素處理，對照組以生理鹽水處理。

1.3血清乳酸脫氫酶(LDH)活性和肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性的測定 再灌注5 min后，從各實驗組大鼠采集5 ml靜脈血樣本，使用臺式離心機以5 000 r/min離心5 min，血清保存于液氮中。樣品解凍后進行分析測定。使用7 600全自動生化分析儀及商用試劑盒Creatine Kinase-MB Liquid Reagent和Cytotoxicity Detection Kit (LDH) 測定LDH和CK-MB的活性，作為評價心肌損傷的指標。

1.4Western 印跡測定心肌組織phos-ALDH2和Total-ALDH2蛋白的表達 取血后，迅速剪下各組大鼠的心臟，每只大鼠取相同部位的左心室前壁心肌組織0.2 g，用生理鹽水沖洗，剪碎心肌組織后加入2 ml RIPA裂解液(1 ml RIPA+10 μl PMSF)至玻璃勻漿器中，冰浴下進行機械勻漿，勻漿液在冰上靜置30 min直至充分裂解后，以12 000 r/min 4℃離心30 min，取上清，用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白質濃度。用RIPA裂解液均衡每一樣品中的蛋白液濃度，保證每個樣品孔蛋白上樣量一致，加入5×loading buffer后，于100℃煮沸變性5 min，分裝蛋白上樣液并于-70℃儲存。取50 μg蛋白上樣進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，電泳分離蛋白后，將目標蛋白帶轉移至聚偏氯乙烯(PVDF)膜上，將印跡后的PVDF膜放入盛有封膜液的平皿中室溫孵育封閉2 h。用抗體稀釋液按1∶1 000分別稀釋兔抗大鼠ALDH2抗體和兔抗大鼠Phos-ALDH2抗體，按1∶500稀釋抗大鼠β-actin抗體，將PVDF膜蛋白面朝下放于抗體液面上，4℃孵育過夜。用Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗滌PVDF膜3次，5 min/次。然后將膜用TBST(1∶2 000)稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG二抗室溫下孵育2 h后，用TBST室溫下洗膜3次，10 min/次。增強化學發光法(ECL)顯色。將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值等記錄相應的表達量，得出磷酸化ALDH2占總ALDH2的比例。

1.5統計學分析 采用SPSS15.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

粗糠柴毒素處理顯著抑制大鼠MIRI所導致的血清CK-MB和LDH升高。另外，粗糠柴毒素處理使I/R心肌細胞ALDH2磷酸化水平顯著增加，這提示粗糠柴毒素可能通過激活ALDH2來誘導心臟保護。各組LDH、CK-MB活性及ALDH2磷酸化比例見表1。典型的Western 印跡條帶，見圖1。

表1 兩組LDH、CK-MB活性與phos-ALDH2/Total-ALDH2比值比較

圖1 Western 印跡結果

3 討 論

自從1994年粗糠柴毒素被首次報道以來，關于粗糠柴毒素藥理作用的研究一直在進行〔7〕。目前已發現的作用包括抗過敏、誘導腫瘤干細胞自噬及凋亡以及抑制腫瘤細胞轉移等〔8～11〕。也有文獻報道〔6〕粗糠柴毒素有希望作為新的腫瘤化療藥物。

關于粗糠柴毒素的作用機制至今尚存在爭議。最初認為粗糠柴毒素是一種選擇性的PKCδ抑制劑〔7〕，并用于大量對PKCδ生物學功能的研究中〔6〕。然而，隨后有證據表明在很多條件下粗糠柴毒素對PKCδ活性并無直接影響，而且特異性不強，對蛋白激酶家族的多個成員如PKB、PRAK等均具有抑制作用〔12〕。也有研究表明在PKCδ敲除的大鼠中，粗糠柴毒素還可表現其抑制蛋白磷酸化的作用〔13〕。目前一般認為粗糠柴毒素的作用機制復雜，存在PKCδ依賴和非PKCδ依賴兩類途徑〔6〕。粗糠柴毒素的線粒體氧化磷酸化解耦聯作用已被證明不依賴于PKCδ，其下游事件可能是粗糠柴毒素多種生物學功能的真正機制〔14〕。

粗糠柴毒素與細胞凋亡的關系也較為復雜。研究證實粗糠柴毒素有促凋亡與抑制凋亡的雙重作用，且可能為PKCδ依賴或非PKCδ依賴性〔14〕。已有研究〔10〕表明粗糠柴毒素具有胰腺腫瘤干細胞凋亡的作用，而本研究中粗糠柴毒素表現為抑制I/R心肌細胞的凋亡及物質釋放。ALDH2作為一種醛類代謝的關鍵酶，在清除缺氧條件下產生的毒性醛類起關鍵作用，其磷酸化參與了多種藥物預處理方式如乙醇預處理〔5〕、麻醉預處理〔15〕等誘導的心臟保護。本實驗提示了無論粗糠柴毒素在對抗MIRI方面的機制如何，這一物質最終能夠激活ALDH2保護通路，減輕I/R引起的心肌細胞死亡。雖然粗糠柴毒素尚未被批準藥用〔16〕，且其作用機制有待于進一步闡明，然而本研究提示了一種新的藥物預處理方式，對MIRI的機制研究提供了新的途徑。

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