染料木素對阿爾茨海默病模型大鼠海馬區神經遞質含量的影響

李長興 祁存芳 李建華 代冬芳 黃明玉 唐延軍

(青海大學醫學院人體解剖學教研室，青海 西寧 810001)

流行病學調查表明，阿爾茨海默病(AD)的發病與女性雌激素水平降低、缺乏有關〔1，2〕。臨床試驗表明，雌激素替代治療可以改善AD患者的認知能力，但鑒于可能出現的嚴重副作用，人們開始關注具有雌激素效應、并能防止雌激素替代治療出現的副作用的植物雌激素〔3〕。大豆異黃酮是從大豆中提取出來的具有弱雌激素樣作用的異黃酮類化合物，其中染料木素是大豆異黃酮中作用最強的一種化學物質〔4，5〕。本研究試圖通過觀察雌激素去除后腦部海馬區乙酰膽堿(Ach)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)及5-羥色胺(HT)遞質含量的變化，及染料木素的干預作用，探討染料木素影響學習記憶功能的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選用12周齡健康雌性SD大鼠30只，體重180～200 g (蘭州大學動物實驗中心提供)。

1.2AD動物模型制備 β-淀粉樣肽(Aβ)由美國Sigma公司提供。用生理鹽水將Aβ1～40稀釋成10 μg/μl，37℃孵育1 w，使其變為聚集狀態的Aβ1～40。SD大鼠10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于立體定位儀上，常規備皮消毒，切開頭部皮膚，暴露硬腦膜。定位海馬齒狀回背側細胞帶(前囟后3.3 mm，旁開1.5 mm，顱骨表面下3.3 mm)。微量進樣器自腦表面垂直進針，緩慢將Aβ1～401 μl(10 μg/μl)注入，注射速度為5 μl/h，留針0.5 h，使Aβ1～40充分浸潤局部組織，縫合切口，常規飼養。

1.3動物分組和藥物處理 隨機分為假手術組(Sham)、卵巢切除組(Ovx)、卵巢切除+17β-雌二醇1.0組(Ovx+Est)、卵巢切除+17β-雌二醇1.0+染料木素1.0組(Ovx+Est+Gen1.0)、卵巢切除+17β-雌二醇1.0+染料木素10.0組(Ovx+Est+Gen10.0)，每組6只。大鼠經氯胺酮腹腔注射麻醉后，摘除雙側卵巢；假手術組(Sham)手術過程與切除組相同，但不切除卵巢而只切除卵巢周圍小塊脂肪組織。隔日皮下注射給藥21 d后取大鼠海馬及子宮組織。Ovx+Est組給予1.0 mg/kg體重17β-雌二醇；Ovx+Est+Gen1.0組給予1.0 mg/kg體重的17β-雌二醇和1.0 mg/kg體重Gen；Ovx+Est+Gen10.0組給予1.0 mg/kg體重的17β-雌二醇和10.0 mg/kg體重Gen，上述藥品溶媒均為芝麻油。Sham組、Ovx組每天給予等體積的芝麻油。

1.4Morris水迷宮測定 待Aβ1～40注射2 w后再測水迷宮潛伏期。即記錄大鼠從入水到找到并爬上平臺的時間，此時間稱逃避潛伏期。每一時間段內4次潛伏期的算術平均數為這一時段的成績進行統計分析。

1.5標本取材、神經遞質含量和活性檢測 實驗各組藥物處理21 d，麻醉后快速斷頭取腦迅速分離海馬。同時分離大鼠的子宮并稱重，作為觀察雌激素作用的指標(子宮系數=子宮濕重/大鼠體重)。海馬區Ach的測定采用酶聯免疫法；5-HT，NE，DA的測定采用高效液相(HPLC)測定。

2 結 果

2.1大鼠子宮濕重測定結果 與Sham組比較，Ovx組子宮重量明顯降低(P<0.05)。與Ovx組比較，Ovx+Est組的子宮重量增加(P<0.05)；與Ovx+Est組相比，Ovx+Est+Gen1.0組子宮重量顯著降低(P<0.05)，但Ovx+Est組與ovx+Est+Gen10.0組之間無顯著性差異(P>0.05)。表1。

2.2Morris水迷宮結果 與Sham組相比，Ovx組AD大鼠的水迷宮逃避潛伏期明顯增長(P<0.01)；Ovx+Est組AD大鼠的水迷宮逃避潛伏期與Ovx組相比明顯縮短(P<0.01)；與Ovx+Est組相比，Ovx+Est+Gen1.0組AD大鼠的水迷宮逃避潛伏期明顯增長；Ovx+Est+Gen10.0組AD大鼠的水迷宮逃避潛伏期縮短，但與Ovx+Est組相比無統計學意義。見表2。

表1 AD模型大鼠子宮重量與子宮系數比較±s)

表2 AD模型大鼠逃避潛伏期比較±s)

2.3神經遞質含量測定 與Sham組相比，Ovx組神經遞質含量均降低；Ovx+Est組與Ovx組相比，Ovx+Est組神經遞質含量明顯增加(P<0.01)，與Ovx+Est組相比，Ovx+Est+Gen1.0組神經遞質含量均降低；Ovx+Est+Gen10.0組與Ovx+Est組相比無統計學意義。見表3。

表3 AD模型大鼠海馬區神經遞質含量測定±s,n=6)

3 討 論

流行病學調查表明，AD的發病有明顯的性別差異，絕經后婦女的發病率較同齡男性高1.5～3.2倍〔6〕。這可能是老年婦女由于雌激素缺乏而使患AD的危險性增加，即與喪失了雌激素的保護作用有關〔7，8〕。而男性可繼續產生睪酮，后者在腦內的P450芳香化酶的作用下轉變成雌激素〔9〕。臨床試驗表明，絕經婦女接受雌激素治療可降低AD發病的危險性，推遲AD的發病時間。但長期使用雌激素可增加子宮內膜癌、乳腺癌、卵巢癌的發病率，限制了它的應用。鑒于雌激素替代治療可能出現的嚴重副作用，人們開始關注具有雌激素效應、并能防止雌激素替代治療出現副作用的植物雌激素。研究發現，從大豆、三葉草、葛根等植物中提取出來的具有雌激素活性的異黃酮類化合物，具有雙重效應，在較低劑量時與雌激素競爭產生抗雌激素作用，而在較高劑量時可激活因雌激素不足而未能激活的ER，產生雌激素樣作用〔10〕。

本研究結果顯示，低劑量染料木素和雌激素同時處理時，可以降低海馬區Ach、5-HT、NE、DA的含量，拮抗雌激素的上調作用，同時低劑量染料木素處理組逃避潛伏周期大于單純雌激素處理組。這可能與以下機制有關：低劑量染料木素可能發揮雌激素拮抗作用，增加膽堿能M和N受體的結合位點的數目，促進Ach與膽堿能受體的結合；促進突觸前膜對高親和力膽堿的攝取；增加5-HT受體濃度；干擾DA受體介導的神經細胞鈣通道改變引起的鈣內流，影響AD大鼠學習記憶功能；大劑量染料木素和雌激素同時處理時，作用與單獨給予雌激素作用相似，可能是通過模擬雌激素而發揮作用〔11，12〕。

綜上所述，植物雌激素染料木素對AD大鼠具有神經保護作用，可提高認知功能；其作為植物雌激素，在制藥、營養保健品等領域具有廣泛的應用前景。

4 參考文獻

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