丹參酮ⅡA誘導PC-3細胞凋亡的細胞周期調控機制

康鄭軍 李 偉 王 坦 朱艷琴 沈曉君

(鄭州大學第五附屬醫院，河南 鄭州 450052)

前列腺癌嚴重威脅男性健康。內分泌治療通過去除或阻止雄激素對前列腺癌細胞產生作用，暫時抑制前列腺癌細胞的生長，延緩疾病的惡化進展，但晚期特別是轉變為雄激素非依賴性的前列腺癌，則成為臨床治療的難點。丹參酮ⅡA是從丹參中提取出來的脂溶性有效成分之一，本實驗通過觀察丹參酮ⅡA對PC-3人前列腺癌細胞周期及細胞周期調控相關蛋白CyclinD1和CDK4表達的影響，探討其拮抗PC-3增殖的機制。

1 材料與方法

1.1細胞株 PC-3人前列腺癌細胞購自中國科學院細胞庫。

1.2藥品及試劑 丹參酮ⅡA對照品購自中國藥品生物制品鑒定所,20 mg/瓶,批號：200619。鼠抗人CyclinD1單克隆抗體，兔抗人CDK4單克隆抗體，羊抗鼠FITC-IgG(1∶400)，羊抗兔FITC-IgG(1∶400)試劑均購自Santa cruz。胎牛血清購自杭州四季青公司；胰蛋白酶、DMEM為Gibco BRL產品。

1.3主要儀器 BD公司FACS Calibur流式細胞儀；蘇凈集團安泰公司209b型超凈工作臺；德國GMBH公司Hera CO2細胞培養箱；日本Olympsu Optical公司BH-NIC-B型倒置顯微鏡。

1.4細胞培養與實驗分組 在37℃、5%CO2條件下，用加入終濃度為100 mg/L的鏈霉素與青霉素、含有10%小牛血清的PRMI-1640培養基培養PC-3細胞，含0.01%EDTA的0.25%胰酶進行消化傳代，處于對數生長期的第3～5代細胞用于實驗。按1×108/L密度稀釋后接種于96孔培養板每組設6個復孔，培養24 h。將細胞分為對照組和丹參酮ⅡA處理組。丹參酮ⅡA處理組分別加入終濃度0.25、0.5、1 mg/L的丹參酮ⅡA，培養48 h后，終止培養。

1.5MTT法細胞增殖能力檢測 收集細胞，各組加入 MTT(5 mg/ml)液20 μl/孔，繼續培養4 h，去上清，加入150 μl/孔二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，上酶標儀490 nm處測吸光度值。

1.6細胞周期分析 取生長狀態良好的細胞胰酶消化后制備細胞懸液，1 000 r/min，離心5 min，棄上清；PBS洗滌2次；離心去PBS，加入冰預冷的70%的乙醇固定，4℃避光固定過夜。800 r/min離心10 min，去上清，PBS清洗兩次；重懸細胞于500 μl含100 U/ml RNaseA 的PBS 緩沖液中，避光37℃，溫浴30 min；加2 mg/ml 碘化丙啶(PI)至終濃度50 μg/ml，混勻，避光孵育30 min。以PI熒光讀數為橫坐標，細胞數為縱坐標，用流式細胞術(FCM)檢測細胞周期中不同時相的細胞數。

1.7細胞周期調控相關蛋白CyclinD1、CDK4表達的檢測 調整細胞濃度為1×106/ml個，將細胞懸液置于試管中，加入兔抗人CDK4單抗(1∶100)、鼠抗人CyclinD1(1∶100)100 μl，室溫孵育30 min，PBS洗滌1次，300～500 r/min離心5 min，去上清，加入羊抗兔FITC-IgG 二抗(1∶400)、羊抗鼠FITC-IgG(1∶400)100 μl，避光室溫孵育30 min，PBS洗滌1次，300～500 r/min離心5 min，棄上清，加入1 ml PBS液，500目銅網過濾后上機檢測，同時設PBS代替一抗和二抗、僅加一抗、僅加二抗的陰性對照，每份標本測定5 000個細胞。

1.8統計學方法 采用SPSS10.0軟件包進行單因素方差分析和LSD方法。

2 結 果

2.1丹參酮ⅡA對PC-3細胞增殖能力的影響 與對照組(0.98±0.02)比較。0.25、0.5、1 mg/L的丹參酮ⅡA組OD值(490 nm)分別為(0.79±0.03)、(0.77±0.02)、(0.75±0.03)，顯著降低(P<0.05)。

2.2丹參酮ⅡA對PC-3細胞周期的影響 丹參酮ⅡA 3個藥物劑量組S期細胞數均明顯減少，G0/G1期細胞數均增多，與對照組比較差異顯著(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 丹參酮ⅡA對PC-3細胞增殖周期的影響±s,%，n=6)

2.3丹參酮ⅡA對PC-3細胞CyclinD1、CDK4表達的影響 丹參酮ⅡA處理組細胞CyclinD1、CDK4表達隨丹參酮ⅡA劑量增加而明顯減少，與對照組比較差異顯著(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 丹參酮ⅡA對PC-3細胞CyclinD1、CDK4表達的影響±s,n=6)

3 討 論

細胞周期是一個按特點順序發生的復雜過程，涉及大量調節蛋白，其核心是Cyclin和CDK，二者在細胞周期的各個階段者細胞生命活動的過程。CDK通過與Cyclin結合，形成周期素依賴性激酶復合物而活化，活化的CDK可使其底物蛋白的絲氨酸和蘇氨酸發生磷酸化修飾，并進而引發與細胞周期進程相關的一系列變化〔1〕。Cyclin是通過活化CDK來調控細胞周期的蛋白家族，其本身沒有酶活性。當細胞中含量低時，Cyclin與CDK解離，CDK的活性因而受到抑制。CDK4、CyclinD1均為重要的細胞周期蛋白調控基因，CDK4是CDK復合物中的催化亞基，CyclinD1/ CDK4在G1/S期過渡中發揮重要的調控作用，即CyclinD1和CDK4作為細胞分裂周期起始點G1/S期的正性調節因子，驅動細胞由G1期前行，使細胞分裂加速〔2〕。G1末期向S期是否順利過渡意味著細胞是否由G1期進入S期，此時細胞內相關基因表達水平發生及時而有顯著變化，為下階段DNA復制做好準備，因此這一轉變對于推進腫瘤細胞周期進程具有重要意義〔3〕。

丹參酮是丹參根乙醚提取物中的成分，為丹參主要有效作用部位，丹參酮ⅡA是其脂溶性成分的代表〔4〕。研究表明，丹參酮ⅡA除了傳統的心血管藥理作用外，還可以通過誘導凋亡、抑制侵襲和轉移等多種機制發揮抗腫瘤作用,具有開發成低毒高效抗腫瘤藥物的廣闊前景。李健等〔5〕研究發現，丹參酮ⅡA可誘導人乳腺癌細胞MDA-MB-231凋亡，其機制與細胞周期阻滯、上調凋亡相關基因的表達有關。王江峰等〔6〕研究證實丹參酮ⅡA可通過干預細胞周期促進人耐藥非小細胞肺癌細胞株凋亡。本研究結果證實丹參酮ⅡA可抑制PC-3細胞增殖，其主要機制與CyclinD1及CDK4的低表達所致的細胞周期抑制有關。但是，丹參酮ⅡA這種藥理學作用途徑有待研究。

4 參考文獻

1Suryadinata R,Sadowski M,Sarcevic B.Control of cell cycle progression by phosphorylation of cyclin-dependent kinase(CDK)substrates〔J〕.Biosci Rep，2010；30(4):243-55.

2Gopinathan L，Ratnacaram CK，Kaldis P.Established and novel Cdk/cyclin complexes regulating the cell cycle and development〔J〕.Results Probl Cell Differ，2011；53(11):365-73.

3袁春意,謝 瓊.丹參酮ⅡA在腫瘤領域的實驗研究進展〔J〕.中醫藥導報,2009；15(9):67-9.

4張 萌,錢亦華,唐安琪.丹參酮ⅡA藥理作用的研究進展〔J〕.醫學綜述,2010；16(17)：2661-4.

5李 健,武 彪,李映良.丹參酮ⅡA對人乳腺癌細胞MDA-MB-231作用的實驗研究〔J〕.軍醫進修學院學報,2012；33(7)：754-6.

6王江峰,周卸來,袁 紅,等.丹參酮A對人肺癌細胞株A549/CDDP細胞增殖和凋亡的影響〔J〕.實用腫瘤雜志,2010；25(6):684-8.