四君子湯和理中湯對脾虛腸易激綜合征大鼠一氧化氮信號通路及胃動素表達影響的差異

段永強 程衛東 李蘭珍 成映霞 程 容 楊曉軼 張 晶 杜 娟

(蘭州大學基礎醫學院中西醫結合研究所，甘肅 蘭州 730020)

腸易激綜合征(IBS)是由于腸道動力學和內臟感覺異常所導致的胃腸道功能性疾病，以持續存在或間歇發作的排便習慣改變、糞便性狀異常(稀便、黏液便)、腹脹及腹痛等為表現的臨床綜合征。流行病學研究表明我國IBS患病人群以腹瀉型為多發，由于IBS缺乏可解釋癥狀的形態學改變和生化異常〔1〕，故目前認為腹瀉型腸易激綜合征(D-IBS)與精神因素，胃腸激素分泌紊亂，炎癥介質及免疫因子促發等因素有關〔2〕，現代醫學對此病尚無完全有效治療藥物。祖國傳統醫學認為D-IBS與中醫脾虛證或脾虛為主證的臟腑病證密切相關〔3，4〕，臨床多應用以益氣健脾止瀉或溫中健脾止瀉類中藥復方為主進行干預，療效顯著。本研究探討四君子湯和理中湯對D-IBS大鼠血清及小腸組織一氧化氮信號通路(NO/NOS)及胃動素(MOT)表達差異的影響。

1 實驗材料

1.1動物 采用SPF級Wistar大鼠，雌雄各半，3月齡，體重(180±20)g，由甘肅中醫學院醫學實驗中心提供(動物合格證號SCXK〔甘〕2011-0001-0001011；實驗設施合格證SYXK〔甘〕2011-0001-0000315)。

1.2藥物與試劑

1.2.1四君子湯 以人參、白術、茯苓、甘草原藥材按3∶3∶3∶2比例配制并加工，第1次加10倍量蒸餾水浸泡4 h。按常法煎煮2次，每次40 min，濾出藥液置70℃～80℃水浴濃縮至每1 ml藥液含生藥2 g，冷卻后4℃冰箱備用，用時配至所需濃度。

1.2.2理中湯 以人參、白術、干姜、甘草原藥材按1∶1∶1∶1比例配制并加工，第1次加10倍量蒸餾水浸泡4 h。按常法煎煮2次，每次40 min，濾出藥液置70℃～80 ℃水浴濃縮至每1 ml藥液含生藥2 g，冷卻后置4℃冰箱備用，用時配至所需濃度。

1.2.3番瀉葉制劑 將番瀉葉粉碎成粉，用蒸餾水浸泡，置于50℃水浴6 h濃縮為含量1 g/ml藥劑，去渣取汁4℃保存,使用時稀釋至所需濃度。以上中藥原藥材均購自蘭州復興厚中藥材有限責任公司，并經甘肅中醫學院藥學系中藥生藥學教研室楊扶德教授鑒定合格。

1.3試劑盒 考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒，批號20110925；一氧化氮(NO)試劑盒，批號20110923；一氧化氮合酶(NOS)試劑盒，批號20110926(南京建成醫學生物研究所)；胃動素(motilin，MOT)放免試劑盒(北京華英生物技術研究所，批號20111010)。

1.4主要儀器 DF110型電子分析天平(常熟衡器工業公司，江蘇省常熟市)；721型可見光分光光度計(北京瑞利分析儀器制造公司，北京)；XYJ80-2離心機(江蘇省金壇市恒豐儀器制造有限公司，江蘇省金壇市)；HH-4數顯恒溫水浴箱(常州國華電器有限公司，江蘇省常州市)；FT-630G微機多探頭r計數器(科大創新股份有限公司中佳分公司，安徽省合肥市)；KDC-2044低速冷凍離心機(科大創新股份有限公司中佳分公司，安徽省合肥市)。

1.5實驗方法

1.5.1分組與造模 適應性飼養6 d后，受試動物按體重編號，用隨機數字表法〔5〕分為空白組(n=10)和造模組(n=60)。除空白組外，造模組大鼠參照文獻〔6〕造模：以番瀉葉煎劑溶液(0.4 g/ml)按10 ml/kg劑量灌胃，1次/d；在灌服完番瀉葉煎劑1 h后,即用粗制棉繩束縛大鼠的兩后肢，使之行動不便，躁動不安，造成一定應激刺激，持續2 h，1次/d，以上兩法復合連續造模時間持續14 d。造模結束后篩選符合D-IBS模型大鼠，并采用隨機法分為D-IBS模型組、四君子湯組、理中湯組，每組10只，雌雄各半分籠飼養。

1.5.2給藥方法 造模14 d結束后，四君子湯組給予20 g·kg-1·d-1四君子湯藥劑灌胃，理中湯組給予20 g·kg-1·d-1理中湯藥劑灌胃，等效劑量按照實驗動物研究“等效劑量”計算方法(按60 kg成人體表面積換算標準劑量2倍量)折算，灌胃容積為10 ml/kg體重，連續灌胃給藥14 d，空白組、IBS模型組給予同體積蒸餾水灌胃；各組均以蒸餾水、標準飼料喂養。

1.5.3胃排空實驗 參照文獻〔7〕：從第14天晚上8時開始禁食、不禁水至第16天早晨8時，共禁食36 h。給半固體營養糊2 ml，30 min后用10%水合氯醛麻醉后股動脈采血，制備待檢標本。隨后迅速打開腹腔，結扎幽門和賁門后取出胃，清除胃表面的血漬，第1次稱重(胃總重)，后剪開胃體，洗去胃內容物，用濾紙吸干水分第2次稱重(胃凈重)，按公式計算：胃殘留率=(胃總重-胃凈重)/2×100%。

1.5.4小腸推進實驗 參照文獻〔8〕：結扎幽門和回盲部，分離腸系膜，測量幽門至回盲部的長度作為小腸總長度，從幽門至營養糊黑染的距離作為小腸推進長度。按公式計算：小腸推進率=營養糊推進距離(cm)/小腸全長(cm)×100%。

1.5.5標本采集與效應指標檢測

1.5.5.1血清胃動素(MOT)測定 將股動脈取得的3 ml，靜置2 h后離心(2 000 r/min)10 min，取上清，放入尖底管中4℃低溫冰箱保存待測效應指標。

1.5.5.2小腸組織的收集 大鼠處死后，迅速將近胃竇端小腸組織截取，稱重后分別用眼科小剪刀快速剪碎，分別置于勻漿器中，用組織重9倍生理鹽水勻漿(勻漿器的末端置于放冰塊的冷水中)，并以3 500 r/min 離心10 min，取上清液置4℃冰箱保存，采用化學比色法檢測NO/NOS，放免法檢測MOT。

2 結 果

2.1各組大鼠一般生存情況 空白組大鼠始終表現為反應靈敏，活動及飲食量正常，被毛濃密柔順而有光澤，糞便呈棕褐色顆粒狀。D-IBS模型組大鼠多數在第4天即開始出現倦臥、被毛稀疏干枯；第7天后出現怠動少食、消瘦拱背，肛周污穢，部分動物出現脫肛，甚至動作遲緩，同時毛發失去光澤而枯槁、疏散，成群蜷縮或拱背，并逐漸出現體重減輕，大便增多(墊料呈橘黃色)等“脾虛”癥狀(D-IBS模型組1只大鼠因灌胃操作不當致死，尸檢未見明顯異常)。四君子湯、理中湯組大鼠第6天出現輕度倦臥、被毛稀疏干枯；第9天后出現少食、怠動、消瘦，肛周污穢，少部分動物出現脫肛，動作遲緩，大便增多等，第12天后上述癥狀開始減輕或消失，表現為反應較為靈敏，活動及飲食量正常，被毛疏散但有光澤，糞便呈顆粒狀。

2.2各組大鼠胃殘留率和小腸推進率的比較 與空白組比較，模型組大鼠胃殘留率明顯升高，小腸推進率顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，四君子湯和理中湯均能降低胃殘留率和小腸推進率，但以理中湯作用顯著(P<0.05，P<0.01)，且在抑制小腸推進率方面，理中湯組較四君子湯顯著(P<0.05)。見表1。

2.3各組大鼠血清及小腸組織NO/NOS表達差異的比較 見表2。與空白組比較，模型組大鼠血清及小腸組織NO、NOS計數水平有下降趨勢(P<0.01，P<0.05)；經中藥干預后并與模型組比較，四君子湯和理中湯均能升高血清及小腸組織NO、NOS水平，(P<0.05)，且在調節小腸組織NO、NOS方面，理中湯組與四君子湯比較以理中湯作用顯著(P<0.05)。

表1 各組大鼠胃殘留率和小腸推進率的比較±s，%)

表2 各組大鼠血清及小腸組織NO/NOS表達差異的比較±s)

2.4各組大鼠血清及小腸組織MOT表達差異的比較 與空白組比較，模型組大鼠血清及小腸組織MOT水平均顯著升高(P<0.01)；經中藥干預后，四君子湯和理中湯均能降低血清及小腸組織MOT水平(P<0.05，P<0.01)，且在調節小腸組織MOT水平方面，四君子湯和理中湯組比較，以理中湯作用顯著(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清及小腸組織MOT表達差異的比較±s)

3 討 論

IBS是一種臨床最常見的慢性腸功能紊亂疾病，由于該病缺乏可解釋癥狀的形態學改變和生化異常，臨床表現復雜，常以結腸癥狀為主，也可表現為消化道其他癥狀甚至軀體癥狀。目前IBS的病因尚未完全明了，但涉及因素較多，與腸道運動異常、內臟感覺異常、腦腸相互作用、神經免疫機制紊亂等有關。其中腸神經系統(ENS)是胃腸壁內的自主神經系統，具有獨立于大腦而行使其功能的完整結構。研究表明〔7，8〕NOS廣泛分布于胃腸道，其產物NO是非腎上腺素能非膽堿能神經的抑制性遞質，廣泛參與胃腸生理功能。NO不僅在神經傳導、胃腸保護、內分泌調節和宿主防御機制中起重要作用，而且參與多種病理發生的信號轉導〔9〕。生理性的NO對胃動力的影響是一個抑制性過程，具有延緩胃排空功能，而NO分泌不足或過量均可導致胃腸黏膜受損和運動紊亂。已有研究〔10〕發現胃平滑肌細胞和胃肌間神經叢含有大量的NOS，說明了NO在調節胃動力中的重要性。

如 Sjolund等〔11，12〕學者研究表明,IBS的胃結腸反射(進食可以刺激結腸運動，引起結腸收縮增加，從而激發便意，稱為胃結腸反射)多由胃腸激素濃度的變化調節，而且胃腸激素對胃腸道的分泌、運動、吸收、營養和免疫等起著重要作用,它們的分泌異常可導致胃腸道運動紊亂。MOT作為胃腸激素之一，是由22個氨基酸組成的多肽，全部小腸均有分布，其主要作用是促進和影響胃腸運動及胃腸道對水、電解質的運輸。MOT可通過激發消化間期肌電活動Ⅲ相、促進胃強力收縮和小腸分節運動，該運動呈周期性出現并向小腸遠端傳播，故MOT有促進結腸運動的作用〔13〕。臨床研究表明〔14〕IBS患者血漿MOT水平過高時，腸道蠕動加速，臨床表現為腹痛、腹瀉等癥狀。

中醫學基于D-IBS持續存在或間歇發作的“腹瀉、腹痛或食入即瀉”等臨床癥狀群特征，將其歸納為“泄瀉、腹痛”等范疇，認為本病病因在于外邪直中、飲食不節、勞倦體虛等，導致脾胃虛弱，升降失調，或脾虛濕盛，下注大腸，雖病位在腸，但其本在脾，故證候類型多歸納為脾虛證或脾虛濕盛證，亦有大量研究表明脾虛證都存在腸神經系統分泌異常、胃腸道運動和小腸分泌吸收功能紊亂〔15〕，由此提示IBS發生與中醫脾虛證的病機實質關系密切，而且在中醫臨床上諸多醫家常常應用益氣健脾的四君子湯或溫中健脾的理中湯加減治療脾虛腹瀉之癥。經方四君子湯以人參、白術、茯苓、炙甘草四味藥物配伍組成共湊益氣健脾之功，而理中湯以人參、白術、干姜、炙甘草配伍組成共湊溫中健脾之功，兩首復方雖均能治療脾虛腹瀉之證，但理中湯配方中以干姜替代茯苓，加強了溫中散寒，回陽燥濕的功效。

本研究結果提示D-IBS大鼠存在胃腸排空、轉運功能紊亂，NO信號通路關鍵分子和胃腸激素分泌紊亂；D-IBS大鼠經中藥干預后并與模型組比較，四君子湯和理中湯均能降低胃殘留率和小腸推進率，升高血清及小腸組織NO、NOS水平，降低血清及小腸組織MOT水平，說明四君子湯和理中湯調節D-IBS大鼠小腸NO、NOS、MOT作用相似，且理中湯在調節小腸組織NO、NOS、MOT表達水平方面的作用優于四君子湯，提示理中湯較四君子湯去茯苓加用干姜后，加強了溫中散寒，燥濕止瀉之功，說明恢復中土脾之陽氣是中醫藥治療脾虛腹瀉型IBS的作用途徑之一，但四君子湯和理中湯干預IBS的其他作用機制差別還需要深入研究。

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