缺氧對肺動脈血管內皮細胞線粒體膜電位的影響及Ghrelin的保護作用

孫相華 洪文娟 洪志鵬 周 菊 祝艷翠 王亞麗

(昆明醫科大學第一附屬醫院干部醫療科，云南 昆明 650032)

缺氧是引起機體損傷的最常見因素之一，缺氧可以導致肺血管內皮出現明顯損傷，肺血管內皮細胞附于血管腔內壁，它可以分泌多種血管活性物質，如果血管內皮損傷或功能異常，會發生心腦血管疾病。此外，缺氧還會導致肺部血管內皮細胞合成和釋放內皮素(ET)-1升高，并且激活鈣通道或磷脂酰肌醇系統，引起細胞內出現過量的鈣，從而使細胞受到損害〔1〕。線粒體是細胞進行能量代謝的場所，同時線粒體也參與細胞凋亡，線粒體受到破壞會導致細胞死亡。線粒體膜電位(MMP)是用來評價線粒體功能的指標之一〔2〕。Ghrelin是從大鼠胃黏膜提取出的，是生長激素促分泌素受體(GHSR)的內源性配體〔3〕。本研究采用細胞缺氧模型研究缺氧對人肺動脈血管內皮細胞MMP的影響及Ghrelin的保護作用。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 二甲基亞砜(BIO RAD公司)，Ghrelin(Phoenix Pharmaceutical公司)，胰蛋白酶(華美生物工程公司)，人肺動脈內皮細胞(C-008-5C)(美國Cascade Biologies)，Medium200培養基(M-200-500)(Cascade Biologies公司)，一氧化氮(NO)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，細胞培養箱(Asheville1NC公司)，ET放免試劑盒(亞法生物公司)，激光共聚焦顯微鏡(MRC21024，美國BIO RAD公司)，缺氧通氣環(自制)。

1.2制作缺氧通氣環 將內徑1.2 mm的金屬銅管按照培養皿內徑大小作成環狀管，使其緊貼在培養皿內壁。然后在環形管上制出分布均勻的多個微小細孔，用來通氣。封閉環狀管的一端，用直徑相等塑料導管連接另一端，然后通過這個塑料導管連接到氮氧混合氣罐上。

1.3人肺動脈內皮細胞的培養與傳代接種 凍存的人肺動脈內皮細胞采用常規的方法復蘇，用培養液將細胞調整到適合濃度后接種到無菌細胞培養瓶中，在細胞培養箱中培養并傳代。細胞傳到第3代的時候，按1×105/mm的密度接種到培養皿后繼續培養，當細胞長滿培養皿后，進行下一步實驗。

1.4實驗分組 將人肺動脈內皮細胞分為3組：①對照組：只加入細胞培養液；②單純缺氧組：加入細胞培養液，并進行缺氧因素干預；③缺氧+Ghrelin組：加入含有1.0×10-7mol/L Ghrelin的細胞培養液，再進行缺氧因素干預。

1.5MMP測定 ①將細胞用Hanks液洗3遍，加入800 μl無血清培養液至培養皿中；再加入2 μl的羅丹明123，在37℃ CO2培養箱中培養30 min，然后用Hanks液洗3遍，加入1.5 ml無血清培養液，然后在激光共聚焦顯微鏡下采集細胞。②用激光共聚焦顯微鏡掃描已標記的細胞，每個細胞掃描200 s，然后測定每個標記細胞MMP值。在細胞培養皿中放置缺氧環對細胞進行缺氧處理，然后用激光共聚焦顯微鏡掃描缺氧后的細胞，同時測定每個標記細胞缺氧后MMP值。③記錄缺氧前、后的最大值熒光值，作為被標記細胞缺氧前后MMP值。

1.7細胞上清液ET-1含量測定 分別取100 μl培養細胞上清液，按照ET-1測定試劑盒說明書處理上清液后應用放射免疫伽瑪計數器檢測。

1.8統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行t檢驗和單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組MMP變化 與對照組〔(35.46±3.08)Δφm〕比較，單純缺氧組MMP水平〔(27.89±3.76)Δφm〕明顯降低(P<0.05)。與單純缺氧組比較，缺氧+Ghrelin組內皮細胞MMP水平〔(32.89±2.18)Δφm〕明顯升高(P<0.05)。對照組和缺氧+Ghrelin組內皮細胞MMP水平無顯著差別(P>0.05)。

2.2各組細胞培養液ET-1含量比較 單純缺氧組上清液ET-1水平〔(113.65±11.98)pg/ml〕高于對照組〔(42.85±6.12)pg/ml〕(P<0.05)，缺氧+Ghrelin組上清液ET-1水平〔(68.21±8.18)pg/ml〕明顯低于單純缺氧組(P<0.05)。

2.3各組細胞培養液NO含量比較 單純缺氧組〔(23.78±4.36)μmol/L〕、缺氧+Ghrelin組上清液NO水平〔(48.18±7.69)μmol/L〕明顯低于對照組〔(59.38±9.28)μmol/L〕(P<0.05)，缺氧+Ghrelin組上清液NO水平明顯高于單純缺氧組(P<0.05)。

3 討 論

血管內皮完整性對于機體保持內皮的生物學功能非常重要。血管內皮不僅是血液與組織間屏障，同時還具有多種其他功能，主要包括維持血管通透性，調節組織與血液間物質交換；合成和分泌一些血管活性因子，調節血管舒縮功能；參與機體炎癥和免疫反應等功能。因此，血管內皮細胞損傷會導致內皮系統功能障礙，它是引起動脈粥樣硬化的因素之一，同時其與高血壓、冠心病、高膽固醇血癥、心力衰竭、糖尿病等發生有關。因此，保護血管內皮和內皮細胞功能是目前防治心腦血管疾病的研究熱點之一。內皮細胞受損主要會影響內皮依賴性舒張因子(EDRF) 和內皮依賴性收縮因子(EDGF)，如NO分泌減少或生物利用度降低，而ET-1等分泌增加等，NO可以維持內皮依賴性舒張活性，降低內皮系統通透性，進而抑制細胞遷移和增殖，同時還可以抑制血小板聚集及白細胞和單核細胞黏附。ET-1是引起血管收縮的物質，ET-1過多分泌對血管的影響主要為：長期收縮血管、促進有絲分裂及血小板和單核巨噬細胞聚集、粘附等的作用。當血管內皮損傷時，會導致氧自由基生成增加，NO分泌將減少，ET-1釋放增多。NO和ET-1是在血管壁分泌的并發揮著非常重要作用，因此其異常會引發血管病變，從而會促進動脈粥樣硬化、冠心病和高血壓等心腦血管疾病的發生發展〔1〕。

線粒體是細胞內的一個具有非常重功能的細胞器，它是細胞進行呼吸、氧化磷酸化，產生能量的主要場所。MMP是評價線粒體功能的重要指標之一。MMP的功能正常與否直接影響線粒體進行氧化磷酸化產生三磷酸腺苷，因此MMP是維持線粒體功能正常所必需的重要條件之一。有研究表明，在許多缺氧、缺血性疾病的病理生理變化過程中，MMP會發生改變，從而導致線粒體腫脹，細胞色素C進入細胞質中，進而激活一些蛋白質系統，引起細胞凋亡。因此，細胞出現凋亡的早期重要表現之一就是MMP的下降〔2〕。

GHSR存在于人體多個器官組織，例如下丘腦、腎上腺、胃腸道等均有表達，在動靜脈血管中也有表達。研究表明，Ghrelin具有生長激素/胰島素樣生長因子依賴和非依賴的心血管保護作用。特別是可以改善血管內皮功能，包括抑制血管內皮細胞凋亡、增加內皮型NO合酶表達、促進血管再生及抑制炎癥反應等。研究表明，外源性Ghrelin可以抑制大鼠肺ET-1過表達，降低肺動脈壓力〔4～7〕。本研究提示Ghrelin能夠維持由缺氧引起的細胞因子水平變化，保護缺氧引起的內皮細胞線粒體功能改變，提高血管內皮細胞對缺氧的耐受，對缺氧引起的血管內皮細胞損傷起到保護作用。

4 參考文獻

1馬貴喜，李鳴皋，韓 磊，等.地爾硫卓對缺氧所致血管內皮細胞線粒體膜電位變化的保護作用〔J〕.海軍總醫院學報，2007;20(3)：129-31.

2陳淑娟，汪新宇，李海燕，等.PGC-1 對血管內皮細胞內線粒體生物合成的影響〔J〕.2010;30(5)：1114-6.

3黎蘭芳，王云開.Ghrdin對血管緊張素n誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷保護作用的研究〔J〕.中國微循環，2008;12(5)：293-5.

4Wang Y，Narsinh K，Zhao L，etal.Effects and mechanisms of ghrelin on cardiac microvascular endothelial cells in rats 〔J〕.Cell Biol Int，2011;35(2)：135-40.

5Scares JB，Leite-Moreira AF.Ghrelin，des-acyl ghrelin and obestatin：three pieces of the same puzzle〔J〕.Peptides，2008;29(7)：1255-70.

6喻 卓，陳 鵬，楊桂梅，等.20(R)-人參皂苷Rg3抗血小板活化因子誘導血管內皮細胞損傷的保護作用〔J〕.昆明醫學院學報，2011;(32)5：7-12.

7魏文華，胡 欣，賀 莉.淫羊藿苷對過氧化氫誘導的血管內皮細胞損傷的保護作用〔J〕.中國現代藥物應用，2013;(7)32：232-3.