辛伐他汀對氧化型低密度脂蛋白刺激SMC增殖的抑制作用

劉 凱 嚴夢彤 瑞 塔 孫 波 苗春生 李相軍 任立群

(吉林大學藥學院實驗藥理與毒理教研室，吉林 長春 130021)

他汀類藥物已成為預防與治療心血管疾病中不可或缺的一部分。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)是經低密度脂蛋白(LDL)氧化而來，是目前公認的導致動脈粥樣硬化(AS)的重要因子。研究顯示，ox-LDL可通過多種途徑誘導血管內皮細胞及平滑肌細胞(SMC)的增殖與凋亡〔1～3〕。辛伐他汀可用于控制血液中膽固醇的含量以及預防心血管疾病，能有效降低心血管疾病、腦卒中等疾病的發生〔4〕。盡管辛伐他汀已成為常用的降血脂及預防AS的藥物，但其機制尚不明了。本研究主要探討辛伐他汀對致AS的主要效應細胞——主動脈SMC增殖的影響。

1 材料與方法

1.1材料 SMC購于中國科學院上海生命科學研究院細胞生物研究所，低糖DMEM培養基購于賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司，標準胎牛血清購于天津市灝洋生物制品科技有限公司，噻唑藍(MTT)、胰蛋白酶(1∶250)購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，二甲基亞砜(DMSO)購于天津市北聯精細化學品開發有限公司。

1.2細胞培養傳代 從液氮中取出細胞凍存管，迅速放入37℃的水浴中，使細胞快速融化，用無菌吸管將細胞液轉入50 ml培養瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基10 ml，輕輕搖勻后放入37℃、5%CO2的培養箱中孵育。待細胞長至80%～90%時，進行常規傳代與培養。

1.3實驗分組 實驗分為對照組、模型組、辛伐他汀低、中、高劑量組。對照組用常規無血清培養液培養，模型組用含100 mg/L ox-LDL的無血清培養液，辛伐他汀低、中、高劑量組分別用含辛伐他汀終濃度為1、2、4 μmol/L的100 mg/L ox-LDL的無血清培養液。

1.4MTT法檢測細胞增殖能力 將處于對數生長期的細胞常規消化、接種至96孔板，接種密度為1×103/孔，待細胞完全貼壁后，換用無血清DMEN培養基繼續培養24 h使細胞生長同步化。吸棄培養液，按1.3所述分別加入條件培養液繼續培養24 h后，每孔加入20 μl 5 mg/L MTT貯存液繼續培養3 h。吸棄上清，每孔加入150 μl DMSO以溶解沉淀，于490 nm處測定每孔OD值。每組設6個復孔，重復3次。

1.5流式細胞術(FCM)檢測細胞周期 將處于對數生長期的細胞常規消化、接種至6孔板，接種密度為5×105/孔，待細胞完全貼壁后，換用無血清DMEN培養基繼續培養24 h使細胞生長同步化。吸棄培養液，按1.3所述分別加入條件培養液繼續培養24 h后吸棄上清，加入0.25%胰酶消化，1 000 r/min，5 min離心收集細胞，棄上清用預冷PBS洗細胞3次，離心棄上清，加入預冷70%乙醇于4℃過夜。1 000 r/min，5 min離心棄乙醇，用預冷PBS重懸細胞5 min。離心棄上清，加入濃度為50 μg/ml的碘化丙啶(PI)1 ml 4℃避光孵育30 min，上機檢測。

1.6統計學分析 采用SPSS19.0軟件，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著差異(LSD)法。

2 結 果

2.1細胞增殖能力檢測結果 MTT結果顯示，與對照組(0.91±0.12)比較，ox-LDL模型組細胞增殖現象明顯增高(1.47±0.12)(P<0.01)，與ox-LDL模型組比較，辛伐他汀高、中、低劑量組均明顯降低(分別為1.02±0.10、1.13±0.08、1.29±0.11)(P<0.05，P<0.01)，辛伐他汀各劑量組間細胞增殖能力未見顯著差異。

2.2細胞周期檢測結果 FCM結果顯示，在G1/G0及G2/M期，各組細胞比較無顯著性差異。與對照組比較，模型組細胞S期比例明顯增加(P<0.01)，蛋白合成期差別不大，但是S期DNA復制期比例明顯增加(P<0.01)。與模型組比較，辛伐他汀高、中劑量組S期細胞所占比例明顯降低(P<0.01)，見表1。

表1 流式細胞術測細胞周期±s,%,n=6)

3 討 論

目前認為，ox-LDL可通過損傷內皮細胞、參與泡沫細胞形成、調控血管SMC增殖等多個方面誘導AS的發生，因此，ox-LDL在AS形成過程中具有十分重要的作用。ox-LDL可通過活性氧的聚集刺激細胞外信號調控激酶磷酸化，隨即刺激血管內皮轉錄因子激活蛋白和內皮素的分泌和表達；ox-LDL還可以抑制前列環素(PGI2)的分泌來共同調控SMC的增殖〔5，6〕。此外，ox-LDL還可刺激內皮細胞釋放血小板源生長因子(PDGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)以及轉化生長因子-β(TGF-β)的表達，進而參與SMC增殖的調控〔7〕。本研究結果顯示，100 mg/L的ox-LDL可明顯刺激體外培養人SMC增殖，與以往研究結果相似。細胞周期分析結果顯示，加入ox-LDL后，S期細胞比例明顯增加，提示ox-LDL可能通過刺激DNA合成，從而促進細胞分裂增殖。他汀類藥物是羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，通過競爭性抑制內源性膽固醇合成限速酶HMG-CoA還原酶，阻斷細胞內羥甲戊酸代謝途徑，使細胞內膽固醇合成減少，從而反饋性刺激細胞膜表面LDL受體數量和活性增加，使血清膽固醇清除增加、水平降低，是目前常用的降血脂藥。除降血脂作用外，辛伐他汀可能還具有改善血管內皮功能、抑制血栓形成、抗炎、抗氧化和穩定動脈粥樣硬化斑塊等作用。本研究結果顯示，辛伐他汀可直接抑制ox-LDL介導的細胞增殖作用，這可能是其延緩AS發生發展及穩定AS斑塊的機制之一。FCM結果分析顯示，辛伐他汀抑制SMC過度增殖作用可能與辛伐他汀能明顯抑制ox-LDL介導的S期細胞數量增加、抑制S期細胞DNA合成有關，其具體機制尚待深入研究。

4 參考文獻

1Chen TC，Chen TL，Chang HC，etal.Oxidized low-density lipoprotein induces apoptotic insults to mouse cerebral endothelial cells via a Bax-miochondria-caspase protease pathway〔J〕.Taxicol Appl Phamacol，2007；219(1)：42-53.

2Liu X，Zhao J，Xu J，etal.Protective effects of a benzoxazine derivative against oxidized LDL-induced apoptosis and the increases of integrin beta4，ROS，NF-kappaB and P53 in human umbilical vein endothelial cells〔J〕.Bioorg Med Chen Lett，2009；19(10)：2896-900.

3Ou HC，Chou FP，Sheu WH，etal.Protective effects of magnobl against oxidized LDL-induced apoptosis in endothelial cells〔J〕.Arch Taxicol，2007；81(6)：421-32.

4劉 冰，柯永勝.他汀類藥物強化調脂改善冠狀動脈粥樣硬化的研究進展〔J〕.實用心腦肺血管病雜志，2013；21(3)：6-7.

5張 良，韓 丹，趙詩萌，等.OX-LDL與單核巨噬細胞相互作用促進動脈粥樣硬化形成〔J〕.中國比較醫學雜志，2013；23(4)：31-6.

6Xu H，Duan J，Wang W，etal.Reactive oxygen species mediate oxidized low density lipoprotein induced endothelin 1 gene expression via extracellular signal regulated kinase in vascular endothelial cells〔J〕.J Hypertens，2008；26(5)：956-63.

7Kona S，Chellamuthu P，Xu H，etal.Effects of cyclic strain and growth factors on vascular smooth muscle cell responses〔J〕.Open Biomed Eng，2009；3(1)：28-38.