咖啡渣提取物對老年癡呆模型小鼠學習記憶能力的影響

譚銀豐 李永輝 張俊清 陳小武 廖小平

(海南醫學院 海南省熱帶藥用植物研究開發重點實驗室，海南 海口 571199)

在目前形勢下，積極的預防老年癡呆癥成為對抗該病的重要途徑。流行病學和實驗研究表明，咖啡具有抗老年癡呆(AD)作用〔1～3〕。咖啡渣是生產咖啡粉過程中咖啡豆經高溫高壓水提取后剩余的副產品。咖啡作為世界三大飲品之一，生產過程中產生大量咖啡渣，有關咖啡渣的再利用，除了用作肥料與燃料外，也在積極探索從咖啡渣中提取油脂〔4〕、制取D-甘露糖〔5〕、開發抗氧化作用〔6〕等。前期研究表明咖啡渣乙醇提取物中含有三萜類化學成分，并對咖啡渣提取物的急性毒性與抗炎作用進行了初步研究。本文擬分析咖啡渣提取物是否具有與咖啡類似的抗AD作用，為咖啡渣的廢物再利用開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級18～22 g雌性昆明種小鼠，由長沙市開福區東創實驗動物科技服務部提供(動物合格證號：HNACSDC20101587)。丙二醛(MDA)測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(南京建成生物工程研究所提供)。SMG-2型水迷宮(中國醫學科學院藥物研究所研制)。咖啡渣由海南力神投資股份有限公司提供。

1.2實驗方法 供試樣品制備將生產速溶咖啡后剩余的咖啡渣烘干，稱取3份，每份800 g，分別加入30%乙醇、60%乙醇、90%乙醇各6 000 ml加熱回流提取2 h，過濾，再分別加入4 000 ml原濃度乙醇提取2 h，過濾，合并2次濾液。回收乙醇，提取物濃縮至濃稠狀。30%乙醇提取物(30ECT)、60%乙醇提取物(60ECT)、90%乙醇提取物(90ECT)得率分別為：3.20%、68.75%、26.65%。

1.3對三氯化鋁、D-半乳糖誘導小鼠癡呆模型影響〔7〕取18～22 g雌性昆明種小鼠120只，每組10只隨機分為12組，分別為空白組、模型組、陽性對照藥組、30ECT 3個不同劑量組、60ECT 3個不同劑量組、90ECT 3個不同劑量組。實驗動物正常飲食飲水，12 h明暗交替飼養適應3 d后，按10 mg·kg-1·d-1灌胃給予蒸餾水配置的1 mg/ml AlCl3，同時腹腔注射生理鹽水配置的24 mg/ml D-半乳糖120 mg·kg-1·d-1,空白組灌胃給予相同體積的自來水，腹腔注射相同體積生理鹽水，連續7 w。腹腔注射后第25天開始灌胃給予相應劑量受試藥物，陽性對照組灌胃給予鹽酸多奈哌齊10 mg·kg-1·d-1,持續給藥24 d。給藥結束后進行方形水迷宮試驗，具體方法如下：正式實驗前2 d，每天訓練各組小鼠3次，訓練小鼠從SMG-2型方形水迷宮起點逃避水面游泳達到終點樓梯。方形水迷宮自動記錄小鼠進入各盲端的錯誤次數與到達終點時間(潛伏期)。第3天進行正式實驗，每組小鼠測試2次，取平均錯誤次數和平均潛伏期。完成方形水迷宮實驗后的小鼠，經摘眼球取血，4 000 r/min離心10 min，取血清，測小鼠血清中MDA、SOD含量。剝離小鼠大腦，用4%甲醛溶液固定。

表1 咖啡渣對癡呆模型小鼠記憶能力的作用±s,n=10)

2 結 果

與空白組相比，模型組小鼠水迷宮測試的潛伏期和錯誤次數明顯增加，與模型組比較，多奈哌齊、30ECT能同時降低小鼠方形水迷宮實驗潛伏期及錯誤次數，其他咖啡渣醇提物均能減少小鼠水迷宮測試錯誤次數，說明咖啡渣乙醇提取物具有潛在的抗老年癡呆作用。各供試藥組小鼠血清SOD、MDA含量與模型組無顯著差異，說明啡渣30EcT、60ECT、90ECT可能不是通過抗氧化作用產生抗老年癡呆作用。見表1，表2。

表2 咖啡渣對癡呆模型小鼠血清MDA含量、SOD活性影響±s,n=10)

3 討 論

鋁是公認導致罹患老年癡呆的重要環境因素之一,Al3+促進脂質過氧化〔8〕，使SOD減少,增強鐵催化的活性氧類(ROS)自由基的生成和脂質過氧化過程〔9〕,使神經細胞膜損傷，促使β-淀粉蛋白(Aβ)聚合，抑制蛋白磷酸酯酶活性，促進微管相關蛋白 (Tau)異常磷酸化，繼而促進神經元纖維纏結(NFT)的形成〔10〕。腹腔注射D-半乳糖經小鼠代謝后產生O2-和H2O2，引起小鼠氧自由基損傷，導致AD模型形成。

本研究表明，咖啡渣的乙醇提取物具有增強AD小鼠學習記憶能力，其中以30%乙醇提取物效果最好。本研究按文獻方法〔11〕測定癡呆模型小鼠血清中SOD、MDA含量，提示老年癡呆模型小鼠血清中MDA含量變化并不敏感，測定腦組織中SOD、MDA含量變化更能反映癡呆小鼠的過氧化產物代謝狀況。

4 參考文獻

1Arendash GW,Moric T,Cao CH,etal. Caffeine reverses cognitive impairment and decreases brain amyloid-β levels in aged alzheimer disease mice〔J〕.J Alzheimer Dis,2009;17(6):661-80.

2Cao CH,John R,Lin XH,etal.Caffeine suppresses amyloid-β levels in plasma and brain of Alzheimer’s disease transgenic mice〔J〕.J Alzheimer Dis,2009;17(6):681-97.

3Arendash GW,Cao CH.Caffeine and coffee as therapeutics against alzheimer’s disease〔J〕.J Alzheimer Dis,2010;20(增刊suppl):S117-26.

4陳祎平，林昭華，梁振益，等.咖啡渣油脂的提取及其脂肪酸組成研究〔J〕.食品科技，2005；12(12)：84-6.

5黃廣明，陳祎平，王 默.咖啡渣制取D-甘露糖工藝中水解條件對糖的收率的影響〔J〕.海南大學學報自然科學版，2002；20(3)：236-9.

6潘文潔，黃曉東，張 玲.咖啡渣提取物抗氧化性及其協同效應的研究〔J〕.食品工業科技，2008；29(11)：130-2.

7Sun ZZ,Chen ZB,Jiang H,etal.Alteration of Aβ metabolism-related molecules in predementia induced by AlCl3 and D-galactose〔J〕.AGE,2009;31(4):277-84.

8Khanna P,Nehru B.Antioxidant enzymatic system in neuronal and glial cells enriched fractions of rat brain after aluminum exposure〔J〕.Cell Mol Neurobiol,2007;27(7): 959-69.

9Takada J,Kaneko N,Yasui H,etal.Memory deficit inmice administered aluminum-malt late complex〔J〕.Biometals,2006;19(1): 83-9.

10Makesbery WR.Aluminum and Alzheimer’s disease〔J〕.Clin Neurosci,1993;1(2):212-8.

11李 菲，郭 蕾，喬之龍.補腎益智湯對老年癡呆模型大鼠治療作用的實驗研究〔J〕.時珍國醫國藥,2010;21(2)：315-7.