紅景天聯合順鉑協同誘導人肺腺癌耐藥細胞的凋亡

黎 萍 于文暢 鄭百紅 李君瑤 張 捷

(吉林大學第二醫院兒科， 吉林 長春 130041)

非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌的75%～80%，其中70%以上的NSCLC確診時為中晚期〔1，2〕。以鉑類為基礎的聯合化療在其綜合治療中占有重要地位，但鉑類的耐藥嚴重地影響了其臨床療效〔3〕。多種天然植物具有抗癌作用，且副作用較小〔4〕。紅景天提取自中草藥紅景天根，具有廣泛的藥理作用〔5〕。研究證實，紅景天能抑制肝癌、肺癌等腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞的凋亡〔6, 7〕。順鉑是鉑類藥物中最經典、最具代表性的藥物；凋亡耐受是腫瘤細胞對順鉑產生耐藥的主要機制之一〔8〕，紅景天能否通過誘導肺癌細胞的凋亡，協同順鉑對肺腺癌耐藥細胞的發揮生長抑制、凋亡誘導的作用，從而增強肺腺癌耐藥細胞對順鉑的敏感性？目前未見相關報道。本研究擬觀察紅景天聯合順鉑對人肺腺癌A549/DDP耐順鉑細胞株的作用。

1 材料與方法

1.1細胞及主要材料 人肺腺癌細胞株A549及其耐順鉑細胞株A549/DDP購自中國醫學科學院腫瘤醫院，兩個細胞株均在RPMI1640培養液(含10%新生牛血清)中，37℃、5% CO2的孵箱內培養。A549/DDP在1 μg/ml順鉑培養液培養7 d以上以維持耐藥性。MTT、順鉑、胰酶、RPMI1640培養基均購自碧云天生物科技有限公司；caspase3、聚腺苷二磷酸-核糖(PARP)抗體一抗購自Santa-cruz公司，辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購自武漢博士德公司。

1.2MTT法檢測紅景天、順鉑對A549/DDP細胞的生長抑制 將A549/DDP細胞以1×104個/孔接種于96孔板，每個濃度設4個復孔。紅景天組細胞加入0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mg/ml梯度濃度的紅景天，順鉑組加入80、40、20、10、5、2.5、1.25 μg/ml濃度梯度順鉑，繼續培養24 h。每孔加入MTT溶液，37℃繼續培養4 h，小心吸棄孔內培養上清，每孔加入150 μl的DMSO振蕩10 min溶解結晶，用酶標儀測吸光度(OD570 nm)值，細胞的生長抑制率的數值(%)=(1-實驗組/對照組)×100%。

1.3流式細胞術檢測細胞的凋亡率 調整細胞濃度為0.5×106接種于培養皿中，設對照組、紅景天組、順鉑組及紅景天+順鉑組，根據細胞生長抑制率，取適宜濃度的紅景天、順鉑作用于A549/DDP細胞24、48、72 h后，收集細胞，Annxni-V和PI染色后，1 h內流式細胞儀檢測凋亡細胞。

1.4Western印跡法檢測凋亡相關蛋白的表達 提取各組細胞的總蛋白，行蛋白定量后，取40 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉，封閉，加入人酶切caspase3、酶切PARP一抗雜交，再加入二抗，按ECL試劑盒說明書發光、曝光。以β-actin為內參照，以目的蛋白的相對光密度值間接表示蛋白含量。所有實驗至少重復3次。用1.8 mg/ml紅景天作用于A549/DDP細胞12、24、48 h，用Annexin-V和PI進行染色后，用流式細胞儀分析凋亡細胞。

1.5統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件包，采用線性回歸計算紅景天及順鉑作用于A549/DDP細胞的IC50。兩組間比較采用t檢驗；采用One-Way ANOVA分析多組間比較，采用LSD法行組間兩兩比較。

2 結 果

2.1A549/DDP對順鉑耐藥性 順鉑作用A549/DDP 24 h的 IC50為(36.41±4.14)μg/ml，而A549細胞的IC50為(7.98±1.23)μg/ml，和A549細胞比，等量的順鉑對A549/DDP抑制作用有限，該結果表明A549/DDP對順鉑明顯耐藥。

2.2聯合應用紅景天及順鉑對A549/DDP細胞的抑制率 紅景天、順鉑對A549/DDP細胞均有生長抑制作用，并呈濃度依賴性。見表1和表2。紅景天對A549/DDP細胞作用24 h的IC50為(1.91±0.32)mg/ml，48 h的IC50為(1.24±0.27)mg/ml。6.0 μg/ml順鉑、1.8 mg/ml紅景天和二者聯合作用于A549/DDP細胞，24 h后抑制率分別為：(24.88±3.72)%、(24.69±1.73)%及(54.6+2.95)%，紅景天+順鉑組與另外兩組差異顯著(F=69.63，P<0.001)。

表1 順鉑對人肺腺癌細胞抑制率的影響±s,n=3,%)

表2 不同濃度紅景天24、48 h對A549/DDP細胞抑制率的影響±s,n=3,%)

2.3聯合應用紅景天及順鉑對A549/DDP細胞凋亡率的影響 藥物作用24 h后，順鉑組細胞凋亡率明顯高于空白對照組(P<0.05)；紅景天組細胞凋亡率均明顯低于聯合用藥組(P<0.05)。見表3。

2.4聯合應用紅景天及順鉑對A549/DDP細胞凋亡相關蛋白表達的影響 各組細胞蛋白電泳結果顯示，凋亡相關蛋白酶切caspase 3以及酶切PARP表達明顯增加，見圖1。

表3 各組A549/DDP細胞的凋亡率±s，n=3,%)

圖1 各組細胞凋亡相關蛋白電泳圖

3 討 論

紅景天為多年生草本或亞灌木野生植物，藥理學研究表明其主要藥理活性成分為紅景天苷〔5〕。紅景天對腫瘤的抑制作用國內外均有報道〔7, 9〕。紅景天在體外對人肝癌HepG2細胞具有顯著的抑制作用〔6〕；本研究顯示，紅景天可明顯增強順鉑對人肺腺癌耐藥細胞A549/DDP的生長抑制與凋亡促進作用。

順鉑通過多種機制發揮抗癌作用，目前已經明確的最重要的機制是順鉑通過引起腫瘤細胞DNA損傷，并激活凋亡信號發揮作用。本研究表明，A549/DDP對順鉑具有一定耐藥性，聯合應用紅景天、順鉑對A549/DDP 細胞的凋亡促進作用明顯增強。已有報道表明，紅景天可能通過干擾細胞代謝、改變細胞外衣的性質抑制肺腺癌細胞體外生長〔10〕。本研究中，紅景天能抑制肺腺癌耐藥細胞的生長，紅景天對A549/DDP的抑制作用呈時間依賴性、濃度依賴性。1.8 mg/ml紅景天可以顯著增強順鉑誘導A549/DDP細胞的凋亡發生，且作用呈時間依賴性。凋亡執行蛋白caspase3以及其作用底物聚(ADP-核糖)PARP分別通過裂解成酶切caspase3及酶切PARP發揮凋亡執行功能。另有研究表明，紅景天可能通過增強機體的抗腫瘤免疫應答，抑制Lewis肺癌小鼠移植瘤的生長〔11〕。

綜上，紅景天與順鉑有協同作用，二者聯合對多藥耐藥肺癌細胞的增殖抑制、凋亡促進的作用顯著加強；紅景天能增強肺癌抗腫瘤免疫應答〔11〕。

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