體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特性及細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路

孫雅彬 王大廣 宋 鄂 葉 飛 張 泳 孫雅敏 徐越超

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院眼科，吉林 長春 130021)

Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在生理和病理情況下均起到重要的作用。解剖發(fā)現(xiàn)，Müller細(xì)胞、神經(jīng)元以及血管之間存在一種特殊的密切的生理關(guān)系，通過Müller細(xì)胞可以快速檢測視網(wǎng)膜的自我平衡并做出回應(yīng)〔1，2〕。視網(wǎng)膜是體內(nèi)耗能最高的組織，Müller細(xì)胞通過新陳代謝為視網(wǎng)膜為提供代謝能量〔3〕。Müller細(xì)胞直接向高耗能的光感受器〔4〕運(yùn)送營養(yǎng)，包括葡萄糖、乳酸鹽、丙酮酸以及氨基酸〔5,6〕。與光感受器完全相反，Müller細(xì)胞對低氧、缺氧癥以及低血糖癥具有很強(qiáng)的耐受能力〔7〕。 Müller細(xì)胞通過糖原沉積，延長了其在有害環(huán)境下的生存期〔8〕。基于Müller細(xì)胞在視網(wǎng)膜中的重要作用，本研究通過體外培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞內(nèi)信號傳統(tǒng)通路的研究，為各種視網(wǎng)膜疾病的機(jī)制研究提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1Müller 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 根據(jù)我們的既往研究體外培養(yǎng)及鑒定大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞〔9〕。于倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)液有無污染，觀察從大鼠視網(wǎng)膜分離出的Müller細(xì)胞貼壁情況，以及細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中的形態(tài)變化、生長特性等。

1.2蛋白通路分析 Müller 細(xì)胞(1×106) 于10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)無血清DMEM培養(yǎng)24 h。用1倍細(xì)胞裂解液(Cell Signaling Technology公司，美國Danvers)包含20 mmol/L Tris-HCl (pH7.5)，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L Na2EDTA，1 mmol/L EGTA，1% Triton，2.5 mmol/L焦磷酸鈉，1 mmol/L β-甘油磷酸鈉，1 mmol/L Na3VO4，1 μg/ml亮抑蛋白酶肽，提取細(xì)胞總蛋白。 每個培養(yǎng)皿中加入300 μL裂解液，用細(xì)胞刮板刮除培養(yǎng)皿表面的單層細(xì)胞。細(xì)胞裂解產(chǎn)物超聲裂解15 s，2次，14 000 r/min，4℃，離心30 min。BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒(Pierce公司，美國Rockford)檢測蛋白質(zhì)濃度。每孔加入300 μg蛋白質(zhì)，10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)至尼龍膜上。將尼龍膜以5%的牛奶或3%牛血清蛋白在室溫下封閉1 h。將尼龍膜固定在免疫印跡雜交盒內(nèi)，雜交盒有20條雜交道，每條雜交道可加2～3種一抗，抗體結(jié)合到蛋白質(zhì)上，4°C孵育過夜。 清晰印記后，與二抗在室溫下雜交1 h。清洗尼龍膜后加入化學(xué)發(fā)光液。用凝膠成像系統(tǒng)拍攝化學(xué)發(fā)光信號。用光密度掃描系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)含量，并且使用內(nèi)參制定測定標(biāo)準(zhǔn)。

1.3信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)分析 應(yīng)用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)，進(jìn)行蛋白質(zhì)之間生物功能的關(guān)聯(lián)性分析。 將PPA中檢測到的表達(dá)的蛋白質(zhì)輸入IPA軟件，進(jìn)行經(jīng)典信號傳導(dǎo)通路的功能性分析〔10〕。以IPA軟件內(nèi)已知文獻(xiàn)中各基因或蛋白質(zhì)的相互作用為基礎(chǔ)，將輸入蛋白質(zhì)之間的直接或間接的作用進(jìn)行分析，并最終構(gòu)建出新的信號通路。

1.4統(tǒng)計分析 所有的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)均在不同時間重復(fù)3次。PPA重復(fù)2次。應(yīng)用IPA軟件進(jìn)行信號通路分析。

2 結(jié) 果

2.1體外培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞的形態(tài) 自大鼠視網(wǎng)膜分離出的原代組織塊為無色半透明，Müller細(xì)胞呈無色透明小圓點(diǎn)狀，漂浮于培養(yǎng)液中(圖1A)；約24～48 h大部分細(xì)胞貼壁生長，呈短梭形，無色透明，組織塊周圍可見短梭形細(xì)胞伸出(圖1B)；3～5 d，細(xì)胞體態(tài)逐漸變長，兩端出現(xiàn)分支，無色透明(圖1C)，7～10 d，細(xì)胞密集生長呈長梭形，平行有序排列，無色透明(圖1D)，可以傳代供實(shí)驗(yàn)使用。

A：原代培養(yǎng)；B：24～48 h；C：3～5 d；D：7～10 d

2.2視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞中的信號傳統(tǒng)網(wǎng)絡(luò) 應(yīng)用146種磷酸化及磷酸化蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)有108種磷酸化和非磷酸化蛋白質(zhì)在體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜Müller中表達(dá)：磷酸化蛋白：p-PKCα, p-PDK1, p-PKC α/βII, p-p53, p-Akt, p-PTEN, p-RB, p-β-catenin, p-c-Jun, p-Stat3, p-ERK, p-GSK-3α/β, p-p70 S6 kinase, p-eIF4B, p-HGFR, p-Smad, p-ERK5 , p-p90RSK, p-CREB, p-PKCδ, p-FAK, p-cdc2, p-Stat5, p-p38；非磷酸化蛋白：FAS, FOXM1, Syk, MetRS, Twist, Lyn, KLF6, CaMKKα, SK3, Stat1, cyclin B1, cyclin D1, Cdk6, Cdc25B, cyclin E, Cdk2, p27, TDP1, Cdk4, HER2, 14-3-3β, cPKCα, ERK, EGFR, SLUG, Cdc25C, Hsp90, CHK1, MDM2, Cdc2 p34, E2F-1, PCNA, p63, p38, Rap 1, β-catenin, Akt, HCAM, XIAP, Bcl-2, patched, HIF-1α, HIF-2α, TTF-1, p53, Notch4, PTEN, SRC-1, Eg5, HIF-3α, Bax, N-cadherin, TNF-α, Cdc42, eIF4B, vimentin, OPN, survivin, E-cadherin, TGF-β, ERβ, WT1, mesothelin, VEGF, ATF-1, Ep-CAM, Bad, NFκB52, NFκB p50, calretinin, IL-1β, H-Ras, Bcl-6, K-Ras, α-tubulin, NFκB p65, CREB, BID, maspin, DRG1, factor XIII B, IGFBP5, HCAM, ICAM-1, ERα, c-Flip, PSM, Rab 7, VCAM-1, FGF-8, NEP, Bcl-xL, endoglin, Bak, TFIIH p89, Nkx-3.1, RIP, NM23, c-IAP2, Epo, uPA, PDEF, Stat 3, ERCC1, uPAR, KAI1, L-selectin, PSCA, E-selectin。

基于IPA結(jié)果，這些蛋白質(zhì)參與了幾條重要的信號傳導(dǎo)通路，包括XIAP/Apoptosis信號通路(p-p53, NFκB p65, p38, Bax, NFκB p50, c-IAP2, TNF-α, Bak, XIAP)，PI3K/AKT 信號通路(p-p53, NFκB p65, p-Akt, p38, 14-3-3 β, Hsp90, p-GSK-3α/β, NFκB p50, Cyclin D1, PTEN)，ILK信號通路(VEGF, NFκB p65, p-Akt, p38, p-GSK-3α/β, HIF-1α, NFκB p50, Cyclin D1, TNF-α, PTEN)，PTEN信號通路(NFκB p65, p-Akt, p-p38, p-GSK-3α/β, NFκB p50, Cyclin D1, Bcl-xL, PTEN)，細(xì)胞周期：G1/S 節(jié)點(diǎn)調(diào)控信號通路(p-p53, p-RB, Cyclin E, Cdk4, Cdk6, Cyclin D1, Cdc2 p34)，HIF-1α信號通路(VEGF, Epo, p-p53, p-Akt, p38, Hsp90, HIF-1α)，細(xì)胞周期：G2/M 節(jié)點(diǎn)調(diào)控信號通路(Cdc25B, p-p53, Cdc25C and Cyclin B1, 14-3-3 β)，HGF信號通路(p-Akt, p-p38, p-Stat3, Cyclin D1, Cdc2 p34)，糖尿病信號通路(NFκB p65, p-Akt, p38, NFκB p50, TNF-α)，NFκB 信號通路(NFκB p65, p-Akt, RIP, IL-1β, NFκB p50, TNF-α)，VEGF 信號通路(VEGF, p-Akt, p38, HIF-1α)，ERK/MAPK信號通路(p38, p-GSK-3α/β, p-Stat3)和胰島素受體信號通路(p-Akt, p38, p-GSK-3α/β, PTEN)。提示Müller 細(xì)胞中信號傳導(dǎo)通路共同決定Müller細(xì)胞的生物學(xué)特性。

3 討 論

Müller細(xì)胞通過上調(diào)營養(yǎng)因子以及抗氧化物為視網(wǎng)膜提供直接和間接營養(yǎng)支持。主要的細(xì)胞因子和生長因子包括腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、堿性纖維母細(xì)胞生長因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、胰島素生長因子1、神經(jīng)膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、白血病抑制因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3以及色素上皮衍生因子〔11～14〕。這些因子可能單獨(dú)或共同起作用并通過直接或間接機(jī)制保護(hù)應(yīng)激的神經(jīng)元。例如，Müller細(xì)胞可能會直接釋放堿性纖維母細(xì)胞生長因子以支持應(yīng)激的神經(jīng)元〔15〕，或者M(jìn)üller細(xì)胞可能會通過激活應(yīng)激誘發(fā)白血病抑制因子或通過注射α2腎上腺素能激動劑上調(diào)堿性纖維母細(xì)胞生長因子〔13,16〕。Müller細(xì)胞也會通過上調(diào)抗氧化物保護(hù)光感受器免受氧化損傷，如谷胱甘肽、鐵氧化酶、血漿銅藍(lán)蛋白以及血紅素氧化酶〔14〕。

Müller細(xì)胞會傳遞能夠吸收和循環(huán)神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)體和酶。谷氨酸是一種基本的視網(wǎng)膜神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，而且必須對它進(jìn)行嚴(yán)格的監(jiān)管以保護(hù)視網(wǎng)膜免受興奮性損傷或者是為高分辨率(高的信噪比)視覺信號而對其進(jìn)行監(jiān)管〔17,18〕。

通過Müller細(xì)胞傳遞的興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體 (EAAT)1～5，尤其是EAAT 1/天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，迅速地將過量的谷氨酸移出細(xì)胞外隙〔2,19〕。然后，通過谷胺酰胺合成酶將谷氨酸轉(zhuǎn)化成谷氨酰胺，谷胺酰胺合成酶是一種位于Müller細(xì)胞中的酶〔20〕，由于這個過程是非常有效率的，所以Müller細(xì)胞對健康視網(wǎng)膜中的谷氨酸是免疫的〔21〕。嚴(yán)格地說，藥理的谷胺酰胺合成酶的抑制作用會導(dǎo)致動物在2 min內(nèi)失明〔21〕。然后，將谷氨酰胺運(yùn)回至光感受器內(nèi)，至此，整個循環(huán)過程結(jié)束〔22〕。Müller細(xì)胞也會為其他的神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)傳遞轉(zhuǎn)運(yùn)體以及再循環(huán)系統(tǒng)，包括γ氨基丁酸和氨基乙酸〔2〕。

本研究的結(jié)果提示Müller細(xì)胞內(nèi)存在多個不同的信號傳導(dǎo)通路，這些信號通路間有交叉與關(guān)聯(lián)，它們共同決定著Müller細(xì)胞的生物學(xué)特性。

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