免疫因素在大鼠肺缺血再灌注損傷中的作用

倪程耀 陳 新 吳勝軍

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心胸外科，浙江 杭州 310053)

肺缺血再灌注(I/R)損傷(LIRI)常發(fā)生在體外循環(huán)手術(shù)、肺移植、肺栓塞治療恢復(fù)血液供應(yīng)后，再灌注引起的組織及器官的損傷〔1〕，臨床癥狀多表現(xiàn)為不減輕反而加重。LIRI是個(gè)復(fù)雜的病理過程，其機(jī)制至今不明，研究〔2〕發(fā)現(xiàn)其與氧自由基、炎性因素、肺部組織細(xì)胞損傷有密切相關(guān)。LIRI后，出現(xiàn)炎性細(xì)胞聚集，細(xì)胞因子大量表達(dá)，并且免疫因子基因敲除鼠的梗死面積明顯減少，進(jìn)一步提示免疫因素在LIRI中存在重要作用。本研究觀察LIRI模型鼠中白細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的變化，來探討免疫因素在LIRI中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取90只健康雄性Wistar大鼠，體重200～300 g，隨機(jī)分為3組，每組30只。I/R組，行左肺I/R；Sham組(假手術(shù)組)，只開胸而不行左肺I/R；C組，對(duì)照組，不采取任何干預(yù)措施，只放血處死大鼠。

1.2動(dòng)物模型建立 經(jīng)耳緣靜脈注射30 mg/kg的苯巴比妥鈉麻醉，氣管切開后插管，接動(dòng)物呼吸機(jī)控制呼吸，呼吸頻率60次/min，潮氣量單側(cè)肺通氣8～10 ml/kg，雙側(cè)肺通氣15～20 ml/kg，呼吸比1∶2。然后經(jīng)胸骨右緣第3～5肋間開胸，離斷周圍組織，游離左肺門，呼氣末時(shí)結(jié)扎右肺門，60 min后開放行再灌注120 min，制成體外肺I/R模型。

1.3標(biāo)本采集及檢測(cè)方法 各組于缺血30 min、再灌注60、120 min時(shí)采集標(biāo)本。采集支氣管肺泡灌洗液(BALF)，采用考馬斯亮藍(lán)染色法對(duì)其總蛋白(TP)的測(cè)定，收集支氣管肺泡灌洗液沉渣，白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)，并采用瑞氏染色進(jìn)行白細(xì)胞分類，計(jì)算中性粒細(xì)胞(PMN)的百分比；取一定的肺組織，應(yīng)用天平稱量其濕質(zhì)量(W)，置于70℃烤箱烘烤48 h后，測(cè)量其干質(zhì)量(D)，W與D比值即為肺組織的濕/干重比(W/D)；取肺組織配制成10%的組織勻漿，腫瘤壞死因子(TNF)-α，IL-1，IL-6，IL-8含量采用ELISA檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)應(yīng)用軟件對(duì)各數(shù)據(jù)的組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1BALF中蛋白含量、炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)及W/D比值的變化 對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)W/D比值、WBC、PMN所占比值及TP含量在C組，Sham組及I/R組中的缺血30 min組不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；I/R組再灌注60及120 min時(shí)，W/D比值、WBC、PMN所占比值及TP含量明顯高于C組及Sham組的對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)；I/R組再灌注120 min時(shí)，W/D比值、WBC、PMN所占比值及TP含量明顯高于I/R組中再灌注60 min(P<0.05)。見表1，表2。

表1 各組W/D比值及BALF中WBC比較±s,n=30)

2.2肺組織勻漿TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量的變化 對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)肺組織勻漿TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量在C組、Sham組不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；I/R組中缺血30 min，肺組織勻漿TNF-α含量明顯高于C組及Sham組(P<0.05)，肺組織勻漿IL-1、IL-6及IL-8含量與C組及Sham組無明顯差異(P>0.05)；I/R組再灌注60及120 min時(shí)，肺組織勻漿TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量明顯高于C組及Sham組(P<0.05)；I/R組中再灌注120 min時(shí)，肺組織勻漿TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量明顯高于I/R組中再灌注60 min(P<0.05)。見表3。

表2 各組BALF中PMN、TP水平比較±s,n=30)

表3 各組肺組織勻漿TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量的變化±s，pg/ml,n=30)

3 討 論

近年來，心肺置換術(shù)、心肺轉(zhuǎn)流術(shù)已經(jīng)成為醫(yī)治晚期心肺疾病的重要手段，然而因LIRI的存在，導(dǎo)致臨床治療情況不減輕反而加重，成為患者術(shù)后恢復(fù)健康的重要障礙，肺移植術(shù)后因LIRI導(dǎo)致死亡的概率高達(dá)16%～25%〔3〕。關(guān)于LIRI的發(fā)病機(jī)制至今不明，多數(shù)研究認(rèn)為其與以下因素有關(guān)，氧自由基的釋放及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，鈣穩(wěn)態(tài)的失衡，炎性物質(zhì)的浸潤(rùn)及免疫因素的干擾，細(xì)胞凋亡，其中免疫作用在其中占舉足輕重的地位。

免疫因素可通過以下途徑參與LIRI的發(fā)病機(jī)制中：①炎性細(xì)胞因子與相應(yīng)受體結(jié)合，激活溶酶體使其溶解消化肺組織；②刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌黏附分子，增加白細(xì)胞的黏附作用及聚集作用；③刺激巨噬細(xì)胞分泌趨化性因子，加重炎癥反應(yīng)，可使PMN大量聚集，導(dǎo)致細(xì)胞壞死，釋放過氧化物和溶酶體酶等，加劇了免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致肺組織的損傷〔4～6〕。已有研究表明，在LIRI后的肺泡灌洗液中，TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8細(xì)胞因子含量顯著高于血漿中水平，提示了免疫反應(yīng)在LIRI的重要性〔7〕。本研究說明在再灌注中確實(shí)存在肺組織的損傷，且隨再灌注時(shí)間的推移，損傷呈加重趨勢(shì)；在LIRI損傷部位，存在較多的白細(xì)胞以及PMN的聚集，且這種聚集作用隨疾病進(jìn)展逐漸加劇。TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8均參與LIRI的發(fā)病機(jī)制中。炎性細(xì)胞因子含量隨疾病的進(jìn)程存在著相對(duì)應(yīng)的變化。這一研究結(jié)果與國內(nèi)相關(guān)研究基本吻合〔8，9〕，提示免疫因素在LIRI疾病中起著重要作用。

綜上所述，LIRI主要病理改變?yōu)榉谓M織內(nèi)皮的廣泛破壞，肺毛細(xì)血管通透性的增加，從而導(dǎo)致肺泡和間質(zhì)的水腫和損傷，其機(jī)制復(fù)雜，早期給予干預(yù)措施，可以大大提高治愈率和預(yù)后恢復(fù)。免疫因素，尤其是炎性細(xì)胞因子，在LIRI的疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，因此針對(duì)病情應(yīng)用抗炎性藥物可能減輕LIRI對(duì)組織器官的損傷。

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