EB病毒對不同分化程度胃癌細胞的易感性

張 科 邰智慧 李淑英 杜海軍 李勁濤 朱麗華 趙 瑩 張云茹 周 玲 曾 毅

(河北聯合大學繼續教育學院，河北 唐山 063000)

EB病毒(EBV)是DNA腫瘤病毒，與多種人類惡性腫瘤有關。近年來研究表明EBV 感染與胃癌的發生有關〔1，2〕，一般認為超過80%的淋巴上皮瘤樣胃癌都有EBV感染,而不同胃癌中,EBV感染表達的基因不同〔3，4〕。本研究以EBV感染體外培養的不同分化程度的胃癌細胞系，分析EBV感染細胞中EBV編碼核抗原EBNA1、EBNA2、潛伏感染膜蛋白LMP1、LMP2A、裂解感染早期基因BARF1、晚期基因BLLF1及BcLF1的表達狀況，探討EBV對不同分化程度胃癌細胞的易感性及EBV相關胃癌發生可能的機制。

1 材料與方法

1.1材料 B95-8細胞、低分化前胃癌細胞株(BGC823)、低分化胃癌細胞株(MKN45)及高分化胃腺癌細胞(MKN28)本室保存。RNA提取試劑盒、逆轉錄PCR試劑盒、RPMI1640細胞培養液、DMEM細胞培養液及小牛血清及2倍Power Taq PCR Master Mix均購于北京百泰克生物公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 用RPMI1640培養液(添加10%滅活的小牛血清，100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素)常規培養B95-8細胞；用DMEM培養液(添加10%滅活的小牛血清，100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素)常規培養BGC823、MKN45及MKN28細胞，每2～3天換液1次。

1.2.2EBV制備 用攜帶EBV的B95-8細胞系制備EBV：用含10%小牛血清的RPMI1640培養液調B95-8細胞濃度為5×105/ml，置33℃培養11 d，取培養上清經0.45 μm濾器過濾后，10 000 r/min，4℃離心2 h，棄去90%的上清液，制備成10倍濃縮的EBV懸液，分裝貯存于-80℃備用。

1.2.3引物設計與合成 根據GenBank提供的EBV基因組序列，設計擴增引物，引物設計后，委托上海生工生物技術有限公司合成。見表1。

1.2.4EBV感染 實驗所用BGC823、MKN45及MKN28細胞株為EBV陰性。取生長狀態良好的3種細胞株，調整細胞濃度為5×103個細胞/ml，當50% 細胞發生匯合時，加入EBV懸液(使EBV與細胞培養液終濃度比為1∶10)繼續培養4 d，然后加入無EBV的細胞培養液傳代，每2天換液1次。

1.2.5細胞形態觀察 將感染EBV的3種胃癌細胞分別置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態，以非感染EBV的3種胃癌細胞作對照實驗。

1.2.6感染細胞各種基因表達狀況的檢測 將感染EBV的傳代細胞及未感染EBV的3種胃癌細胞，分別提取各類細胞RNA，RT-PCR檢測EBV編碼核抗原EBNA1、EBNA2，潛伏感染膜蛋白LMP1、LMP2A，裂解感染早期基因BARF1，晚期基因BLLF1及BcLF1的表達狀況，所用引物如表1。

表1 本研究中使用的擴增引物

2 結 果

2.1細胞形態觀察 細胞形態學改變：倒置顯微鏡下觀察可見，未感染EBV的胃癌細胞株呈梭形，貼壁生長(圖1)，經EBV感染后，梭形細胞圓化、增大；細胞核增大，可見1～3個核仁；胞質豐富，并常見有空泡，細胞呈多形性，細胞增殖旺盛，貼壁生長。用胰酶消化細胞時發現：細胞對附著體的黏著力減弱，細胞相互間的走向失去正常規律性(圖2)。

2.2感染細胞各種基因表達狀況的檢測 提取細胞RNA，以RT-PCR檢測EBV編碼核抗原EBNA1、EBNA2，潛伏感染膜蛋白LMP1、LMP2A，裂解感染早期基因BARF1，晚期基因BLLF1及BcLF1的表達狀況，經瓊脂糖凝膠電泳，感染的親代細胞及傳5代細胞不表達EBNA2、LMP1 和LMP2A，但檢測到EBNA1、BARF1及BcLF1的表達，其片段大小分別為542 bp、524 bp和349 bp(圖3)，同預期片段大小一致。

BGC823細胞

MKN45細胞

MKN28細胞

BGC823

MKN45

MKN28

M1:100 bp ladder;Neg陰性對照;BGC823、 MKN45及MKN28：人低分化前胃癌、低分化胃癌及高分化胃癌細胞：823/EBV、 45/EBV及28/EBV：EBV感染的細胞化胃癌細胞

圖3RT-PCR檢測EBV感染及未感染細胞EBNA1、BARF1及BcLF1表達

3 討 論

BGC823、MKN45及MKN28細胞株分別來源于人低分化前胃癌細胞系、低分化胃癌細胞系及高分化胃腺癌細胞系。近年研究表明：胃癌的發生與EBV感染有關，約2%～16%的胃癌組織中EBV陽性，大多數罕見的淋巴上皮瘤樣胃癌和少部分常見的胃腺癌組織中均檢測到EBV基因組的存在，且可見于各種病理類型的胃癌如高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌〔5～7〕。羅兵等〔8〕用含有EBV的Akata和P3HR-1 細胞毒株感染人胃癌印戒細胞系(HSG-39),結果表明,EBV感染的親代細胞及大部分克隆表達EBNA1，但不表達EBNA2、潛伏期膜蛋白LMP1和LMP2A；親代細胞及所有細胞克隆未觀察到裂解感染。同時觀察到：用P3HR-1毒株的EBV感染可促進HSG-39細胞的生長，而Akata毒株的EBV感染HSG-39細胞則幾次傳代后，細胞死亡。本研究結果顯示:用含有EBV的B95-8毒株分別感染BGC823、MKN45及MKN28細胞株后,可促進細胞的生長,并表達潛伏感染基因EBNA1、裂解早起基因BARF1及晚期基因BcLF1,表明EBV感染胃癌細胞既存在潛伏感染又存在裂解感染。結合羅兵等〔8〕結果可以看出：不同種的EBV毒株感染不同的胃癌細胞克隆，可能有不同的基因表達。

Truong等〔7〕研究的235例胃癌組織中，12例EBV陽性胃癌組織中有4例為高分化腺癌和中分化腺癌，8例為低分化腺癌。因此認為，EBV可能對中低分化胃腺癌較易感。并且感染的EBV幾乎表達在所有癌細胞中，表明EBV感染發生在胃癌形成的早期,感染EBV的腫瘤細胞單克隆增生,從而導致EBV陽性表達在癌細胞組織。王云等〔9〕應用RT-PCR和Southern雜交技術檢測185例胃癌組織，13例EBV陽性胃癌組織中檢測到6例早期基因BARF1的表達，提示早期基因BARF1在EBV陽性胃癌發生過程中可能起重要作用。

總之,用EBV感染不同分化程度的胃癌細胞系，為EB病毒相關胃癌的研究提供了EBV陽性胃癌的細胞模型，為深入探討EB病毒相關胃癌發生的機制提供了前提支持。

4 參考文獻

1Iizasa H,Nanbo A,Nishikawa J,etal.Epstein-Barr Virus(EBV)-associated gastric carcinoma〔J〕.Viruses，2012；4(12):3420-39.

2Zhu S,Sun P,Zhang Y,etal.Expression of c-myc and PCNA in Epstein-Barr virus-associated gastric carcinoma〔J〕.Exp Ther Med，2013；5(4):1030-4.

3Marquitz AR,Mathur A,Shair KH,etal.Infection of Epstein-Barr virus in a gastric carcinoma cell line induces anchorage independence and global changes in gene expression〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2012；109(24):9593-8.

4Tang W,Morgan DR,Meyers MO,etal.Epstein-barr virus infected gastric adenocarcinoma expresses latent and lytic viral transcripts and has a distinct human gene expression profile〔J〕.Infect Agent Cancer，2012；28;7(1):7-21.

5Ryan JL,Morgan DR,Dominguez RL,etal.High levels of Epstein-Barr virus DNA in latently infected gastric adenocarcinoma〔J〕.Lab Invest,2009；89(1)：80-90.

6Kim do N,Seo MK,Choi H,etal.Characterization of naturally Epstein-Barr virus-infected gastric carcinoma cell line YCCEL1〔J〕.J Gen Virol， 2013；94(Pt 3):497-506.

7Truong CD,Feng W,Li W,etal.Characteristics of Epstein-Barr virus-associated gastric cancer：A study of 235 cases at a comprehensive cancer center in USA〔J〕.J Exp Clin Cancer Res,2009；28(1):1-9.

8羅 兵,村上雅尚,柳原五吉,等.EB病毒對人胃癌細胞系HSC-39 感染的研究〔J〕.中華微生物學和免疫學雜志,2002；22(4):379-84.

9王 云,羅 兵,王笑峰,等.胃癌組織中EB病毒的檢測及其增殖期基因的表達〔J〕.中國癌癥雜志,2004；14(3)：217-21.