白黎蘆醇對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

趙 剛 王偉民 楊 帥 羅貴聰 劉曉燕 鐘世鎮

(廣州軍區廣州總醫院神經外科，廣東 廣州 510010)

缺血再灌注對組織的影響主要是缺血后恢復血液供應造成的過量的自由基攻擊，從而引起組織細胞損害〔1，2〕。目前有學者認為腦缺血再灌注損傷的核心病理環節是氧化應激、自由基連鎖反應?？寡趸委熂白杂苫宄穷A防腦缺血再灌注損傷的重要治療措施。白藜蘆醇是一種天然的多酚類化合物，有清除自由基、抗氧化的效果，對于神經系統更有保護作用，但是其作用機制仍無定論〔3,4〕。本研究觀察白藜蘆醇對腦缺血再灌注損傷后各指標的影響，從而探討其保護機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠64只，體重(250 ± 30)g，分為假手術組、腦缺血再灌注組，低劑量組及高劑量組四組，每組16只，由南方醫科大學動物實驗中心提供。

1.2試劑 白藜蘆醇(德寶生化公司)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，德寶生化公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，水合氯醛(中國醫藥集團上?；瘜W試劑公司)。

1.3實驗方法

1.3.1模型復制 假手術組分離大鼠右側頸總動脈及頸內外動脈不插線；腦缺血再灌注組復制模型但不給藥。低劑量組和高劑量組手術前連續7 d經腹腔給藥，1次/d；術前30 min給藥1次，共8次。低劑量組的給藥劑量為15 mg/kg，高劑量組為30 mg/kg。模型復制采用改良線栓法：魚線(進口，直徑0.23～0.26 mm，長4.0 cm)，乙醇消毒，離頭部2 cm處做黑色標記，置于生理鹽水中備用。大鼠術前禁食12 h，采用腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，固定，頸部正中切口，分離右側的頸總動脈(結扎近心端)、頸內動脈(近端備線，遠端放置動脈夾)、頸外動脈(結扎遠心端)及翼鄂動脈(不結扎)，于頸總動脈分叉膨大處做切口，松開頸內動脈的動脈夾并向其內插入魚線(18～20 mm)，稍感阻力后結扎頸內動脈，固定魚線(留10 mm線頭在外面方便抽出)，縫合皮膚。2 h后抽出線栓使血流重新灌注。白熾燈加熱維持術后大鼠體溫，蘇醒后放回鼠籠，自由飲食。

1.3.2神經功能缺損評分 術后24 h進行評分：0分為正常無神經性障礙；1分為動物左前肢不能隨意伸張；2分為左側肢體癱瘓，走路時向左轉圈，出血追尾現象；3分為行走時左側跌倒不能站立或打滾；4分為有意識障礙無自發活動。其中0分和4分的大鼠均為模型復制失敗，應被剔除，剔除后在后續試驗中隨機補充，保證每組大鼠數目不變。

1.3.3MDA含量及SOD活性測定 術后24 h采集各組大鼠尾靜脈血1 ml及損傷側的大腦皮質及海馬組織，加入冰生理鹽水制成腦組織勻漿，3 000 r/min離心靜脈血及勻漿液5 min，取上清液分別采用化學比色法測定兩者的含量，操作嚴格按試劑盒說明書進行。

1.3.4腦梗死體積測定 術后24 h斷頭取腦，于-20℃速凍15 min后取出，去除嗅腦、低位腦干及小腦，冠狀位切成6等分，均放入2%TTC溶液中，37℃避光，孵育30 min，4%多聚甲醛固定拍照后，小心分離白色和紅色組織，分別稱重，計算腦梗死體積：腦梗死體積(%)= 蒼白區重量/(蒼白區重量+非蒼白區重量)×100%。

1.3.5腦組織含水量測定 術后24 h斷頭取腦，用濾紙小心擦拭缺血側腦組織表面水分，稱其濕重，然后置于100℃烤箱內烘至恒重，稱其干重，計算腦組織含水量：腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

2 結 果

2.1各組大鼠神經功能缺損評分、腦梗死體積及腦組織含水量比較 功能缺損評分、腦梗死體積及腦組織含水量由高到低排列依次為腦缺血灌注組、低劑量組、高劑量組與假手術組(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠大腦皮質、海馬及血清中MDA及SOD含量比較 與假手術組比較，腦缺血再灌注組大腦皮質、海馬及血清內的MDA含量明顯升高，SOD活性明顯下降(P<0.05)；與假手術組比較，低劑量組及高劑量組的MDA含量明顯升高，SOD活性明顯下降(P<0.05)；與腦缺血再灌注組比較，低劑量組及高劑量組的MDA含量下降，SOD活性上升，高劑量組變化更明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 各組肺組織病理改變及排斥等級±s,n=15)

表2 各組大鼠大腦皮質、海馬及血清中MDA含量及SOD含量比較±s,n=15)

3 討 論

腦組織對氧化應激非常敏感，易受缺血再灌注氧化損傷〔5〕。腦缺血再灌注損傷時活性氧大量生成，抗氧化酶失活，抗氧化劑消耗使活性氧不能及時清除，氧化系統與抗氧化系統平衡被打破，從而產生氧化應激損傷，SOD、MDA等自由基損傷的指標與其密切相關〔2, 6～8〕。因此，清除體內的氧自由基含量，降低MDA水平、提高SOD活性有助于預防腦缺血再灌注氧化應激損傷。白藜蘆醇是一種天然的清除自由基的化合物，預防性給予白藜蘆醇可使機體免受氧化應激損傷，但是臨床對于其清除自由基抗氧化的機制并不是特別清楚〔9〕。

本次研究說明腦缺血再灌注后會造成神經功能障礙、腦梗死等，而且預防性給予白藜蘆醇能降低神經功能障礙及腦梗死程度，劑量越高，保護作用越強〔10〕。MDA 是一種氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的代謝產物，反映機體內脂質過氧化程度，間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度；SOD是機體內重要的氧自由基清除劑，使生物體免受自由基的攻擊，通常用其活性高低評價機體清除氧自由基的能力〔11〕。本研究結果提示白藜蘆醇對腦缺血再灌注氧化應激損傷的保護機制可能是降低MDA含量，提高SOD活性。

4 參考文獻

1袁 野,楊俊卿,周岐新.腦缺血再灌注致小鼠神經元退行性變進程中自由基水平和SOD-1表達的變化〔J〕.第三軍醫大學學報,2011;33(12):1211-5.

2Zheng JM,Chen XC,Lin M,etal.Mechanism of the reduction of cerebral ischemic-reperfusion injury through inhibiting the activity of NF-kappaB by propyl gallate〔J〕.Yao Xue Xue Bao,2011;46(2):158-64.

3李 萍,杜洪霞,李新華,等.白黎蘆醇對高脂血癥大鼠血脂、血小板聚集、釋放功能的影響〔J〕.細胞與分子免疫學雜志,2010;26(5):502-3.

4李碧俠,趙 芳,任守文,等.白黎蘆醇誘導的去乙?；窼IRT1高表達對豬卵巢顆粒細胞凋亡的影響〔J〕.中國畜牧雜志,2013;49(3):69-71, 80.

5陳 靜,呂瑩瑩,徐舒敏,等.大蒜素對腦缺血再灌注大鼠氧化應激狀態的改善作用〔J〕.血栓與止血學,2012;18(5):217-20.

6Peng B, Guo QL, He ZJ,etal.Remote ischemic postconditioning protects the brain from global cerebral ischemia/reperfusion injury by up-regulating endothelial nitric oxide synthase through the PI3K/Akt pathway〔J〕.Brain Res,2012;1445:92-102.

7Sun J,Tong L,Luan Q,etal.Protective effect of delayed remote limb ischemic postconditioning: role of mitochondrial K(ATP) channels in a rat model of focal cerebral ischemic reperfusion injury〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab,2012;32(5):851-9.

8Tuma RF, Steffens S.Targeting the endocannabinod system to limit myocardial and cerebral ischemic and reperfusion injury〔J〕.Curr Pharm Biotechnol,2012;13(1):46-58.

9劉月強,趙素貞,孟凡民,等.單次低劑量丙泊酚聯合肢體缺血后處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響〔J〕.鄭州大學學報(醫學版),2012;47(2):259-61.

10任俊偉,楊 琴.白藜蘆醇對大鼠腦缺血再灌注氧化應激損傷的影響〔J〕.中國生物制品學雜志,2011;24(3):292-6.

11Yang J, Li J, Lu J,etal.Synergistic protective effect of astragaloside IV-tetramethylpyrazine against cerebral ischemic-reperfusion injury induced by transient focal ischemia〔J〕.J Ethnopharmacol,2012;140(1):64-72.