肝細胞癌中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、熱休克蛋白和谷氨酰胺合成酶的表達及其臨床意義

周新木 陳麗榮

(浙江大學醫學院附屬第二醫院病理科, 浙江 杭州 321000)

由于肝細胞癌易轉移及復發，預后差，如何能在肝細胞癌尚未出現轉移前及早預測、診斷，并及時采取有效措施就成為能否進一步提高肝細胞癌治療效果的關鍵。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)屬于硫酸類肝素糖蛋白聚糖家族中的一員，是通過糖基磷脂酰肌醇結合于細胞表面。在細胞的生長、分化、遷移中起著很重要的作用〔1〕。熱休克蛋白(HSP)70是熱休克蛋白家族中一員，主要調節細胞周期及凋亡，并在腫瘤的發生中起作用〔2，3〕。谷氨酰胺合成酶(GS)作為Wnt信號通路的靶基因，伴隨β-catenin的異常激活而導致許多人類疾病的發生〔4〕。本研究運用組織芯片技術,通過免疫組織化學Envision法檢測肝細胞癌中GPC3、HSP70 和 GS的表達，分析其與臨床病理特征之間的關系，探討它們在肝細胞癌的發生發展、浸潤轉移和預后中的作用。

1 材料與方法

1.1臨床材料 2001年1月至2010年12月在浙江大學醫學院附屬第二醫院和浙江省麗水市中心醫院手術切除肝細胞癌標本182例，全部患者術前均未進行放、化療和免疫治療。92例癌旁肝組織選自距肝細胞癌邊緣5 cm以上的癌旁肝組織。182例中男143例，女39例；年齡38～87(平均61)歲；腫瘤最大徑<5 cm 125例，腫瘤最大徑≥5 cm 57例；高分化(Edmonson分級1～2)81例，低分化(Edmonson分級3～4)101例；有脈管內瘤栓55例，無脈管內瘤栓127例；TNM分期Ⅰ和Ⅱ期117例，Ⅲ和Ⅳ期65例；肝外轉移29例(肺15例，椎體10例，肋骨2例，腎上腺1例，腦1例)，肝內轉移12例，無轉移141例；術后復發75例，無復發107例。

1.2小組織芯片制作 復習組織切片,在相應的蠟塊上選定有代表性的區域并做標記,用自制組織芯片制作工具在一新的空白受體蠟塊上穿孔(直徑1.8 mm),再用相同內徑的空心管從選取的供體蠟塊中穿取組織,準確放入空白蠟塊的小孔內,按序操作,直至將所有組織標本種植于空白蠟塊中。每例取腫瘤及瘤旁組織各1處。通過切片、撈片制作組織芯片。

1.3方法 采用免疫組織化學技術EnVision法, 組織芯片4 μm厚連續切片，常規脫蠟水化后，采用高壓鍋進行抗原修復。鼠抗人GPC3單克隆抗體(clone 1G12)即用型試劑，購自福州邁新公司；鼠抗人HSP70單克隆抗體(clone W27)工作濃度1∶50，購自北京中杉公司；鼠抗人GS單克隆抗體(clone GS-6)工作濃度1∶450，購自美國Chemicon International Inc.公司。抗原經pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液高壓鍋煮沸修復處理，然后進行免疫組織化學染色過程。最后鏡下控制DAB 顯色,蘇木素復染和中性樹膠封固。每次染色均用pH7.2～7.4 PBS溶液代替一抗作陰性對照,用已知的陽性切片作陽性對照。

1.4結果判定 GPC3和GS陽性表達定位于細胞質， HSP70陽性表達定位于細胞質和細胞核。采用二級計分法,首先按染色強度評分: 無色為0分, 淡黃色為1分,棕黃色為2分, 棕褐色為3分; 然后按陽性細胞率評分: 腫瘤細胞內無陽性染色者為0分,陽性細胞率<10%為0分, 10%～25%為1分, >25%～50%為2分，>50%～75%為3分, >75%為4分。將二者相加得綜合免疫組化評分：≤3分為陰性，>3分陽性。

1.5統計學分析 應用SPSS16.0軟件進行χ2檢驗。

2 結 果

2.1組織芯片質量 組織芯片排列整齊，共取材182例，實際有效182例，有效率100%。

2.2肝細胞癌和癌旁肝組織GPC3、HSP70與GS蛋白的表達比較 GPC3在肝細胞癌和癌旁肝組織中主要表達于細胞質，與癌旁肝組織(0.6%)比較，肝細胞癌高表達，陽性表達率為 79.1%，差異顯著(χ2=130.005，P<0.05)。HSP70在肝細胞癌和癌旁肝組織中主要表達于細胞質和細胞核，與癌旁肝組織(0.6%)比較，肝細胞癌高表達，陽性表達率為 79.7%，差異顯著(χ2=132.172，P<0.05)。GS在肝細胞癌和癌旁肝組織中主要表達于細胞質，與癌旁肝組織(4.3%)比較，肝細胞癌高表達，陽性表達率為 77.5%，差異顯著(χ2=128.235，P<0.05)。見圖1。

2.3GPC3、HSP70和GS的表達與肝細胞癌臨床病理特征的關系 GPC3在不同的分化程度、有無脈管內瘤栓、TNM分期和有無轉移的肝細胞癌患者比較中差異顯著(P<0.05)；HSP70和GS在TNM分期、有無轉移和有無術后復發的肝細胞癌患者比較中差異顯著(P<0.05)。見表1。

表1 肝細胞癌不同臨床特征中 GPC3、HSP70和GS蛋白表達比較〔n(%)〕

圖1 肝癌組織GPC3、HSP70及GS表達(Envision，×100)

3 討 論

GPC3屬于硫酸類肝素糖蛋白聚糖家族中的一員，是通過糖基磷脂酰肌醇結合于細胞表面。在細胞的生長、分化、遷移中起著很重要的作用〔1〕。Libbrecht等〔5〕的實驗結果顯示，肝硬化或異型增生轉化為肝癌，其特點為GPC3表達的明顯增強，肝硬化組織中的小灶性病變如出現GPC3陽性則強烈提示為肝癌。本研究結果顯示，GPC3陽性表達率為79.1%，與癌旁肝組織比較差異顯著，并與文獻報道一致〔6，7〕，提示GPC3在肝細胞癌發生和發展中起到重要作用。本研究結果還顯示，GPC3的表達強度與肝細胞癌分化程度、脈管內瘤栓、TNM分期和轉移有關，腫瘤細胞分化越差，臨床分期越高，則GPC3蛋白表達程度越高，提示GPC3與惡性腫瘤細胞侵襲性密切相關，高表達可促進惡性腫瘤細胞轉移，這可能與GPC3可抑制成纖維細胞生長因子介導的肝癌細胞增殖，同時降低肝癌細胞與Ⅰ型膠原、纖維連接蛋白之間的黏附力，增強細胞的遷移和侵襲能力有關〔8〕。

HSP70屬于熱休克蛋白家族中一員，主要調節細胞周期及凋亡，并在腫瘤的發生中起作用〔2，3〕。Tommaso等〔9〕報道HSP70在絕大多數肝細胞癌出現免疫組化陽性表達，包括早期肝細胞癌和高分化肝細胞癌，良性結節病變則陰性，可作為惡性腫瘤標記。本研究結果顯示，HSP70陽性表達見于肝細胞癌的細胞質和細胞核中，陽性表達率為79.7%，與癌旁肝組織比較差異顯著，結合HSP70功能，可能與HSP70抑制細胞凋亡，促進腫瘤進展有關。本研究結果提示HSP70表達增加與肝細胞癌發生、發展有關，并且是肝細胞癌發展和惡化的重要標志。其機制可能是HSP70的高表達介導癌基因與抑癌基因產物的構像成熟和跨膜轉運，同時又介導錯配蛋白的降解，協調腫瘤細胞的蛋白質快速代謝平衡，使腫瘤細胞得以無限增殖〔10～12〕。

GS作為Wnt信號通路的靶基因，伴隨β-catenin的異常激活而導致許多人類疾病的發生〔4〕。有研究報道，GS可作為AFP低水平表達的早期原發性肝癌的新的標記物〔13，14〕。本研究結果顯示，肝細胞癌GS表達水平高于癌旁肝組織，并且與TNM分期、轉移和術后復發顯著相關，臨床分期越高，蛋白表達程度越高，與文獻報道基本一致〔4，15〕。提示GS在肝細胞癌的發生和發展過程中起著關鍵作用，高表達可促進惡性腫瘤細胞轉移，其機制可能是肝細胞癌中GS高表達，可以使腫瘤細胞不僅依賴宿主提供谷氨酰胺而自行合成，從而為腫瘤細胞合成核苷酸提供原料，有利于克服不利的生長環境，而不斷增殖，進而增強了腫瘤的生存能力。

總之，GPC3、HSP70和GS在肝細胞癌的發生發展中起著不同程度的作用，聯合檢測GPC3、HSP70和GS可能有助于判斷肝細胞癌的惡性程度、轉移潛能及預后分析。

4 參考文獻

1Farooq M，Hwang SY，Park MK，etal.Blocking endogenous glypican-3 expression releases Hep3B from G1 arrest 〔J〕.Mol Cells，2003;15(3):356-60.

2張江蘭，張曉麗，侯 勇，等. 膀胱移行細胞癌患者癌組織HSP27和HSP70mRNA的表達及臨床意義〔J〕.中國老年學雜志，2011；31(7)： 1108-10.

3Tommaso LD，Destro A，Seok JY，etal. The application of markers (HSP70 GPC3 and GS)in liver biopsies is useful for detection of hepatocellular carcinoma〔J〕.J Hepatol，2009;50(4):746-54.

4Osada T ,Sakamoto M, Nagawa H ,etal.Acquisition of glutamine syntheatase expression in human hepatocarcinogenesis : relation to disease recurrence and possible regulation by ubiquitin-dependent proteolysis〔J〕. Cancer,1999;85(4): 819-31.

5Libbrecht L，Severi T，Cassiman D，etal.Glypican-3 expression distinguishes small hepatocellular carcinomas from cirrhosis, dysplastic nodules and focal nodular hyperplasia-like nodules〔J〕.Am J Surg Pathol，2006;30(11)：1405-11.

6杜經麗 ，韋立新，王玉蘭. 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3等抗體在肝細胞肝癌中表達及其鑒別診斷意義〔J〕. 中華病理學雜志，2011;40(1)：11-6.

7葉玉清，王鳳華，黃香婷，等. 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的表達在肝細胞癌診斷中意義〔J〕. 中華病理學雜志，2011;40(9)：626-9.

8Kwack MH, Choi BY, Sung YK. Celluar changes resulting from forced expression of glypican-3 in hepatocellular carcinoma cells 〔J〕.Mol Cells, 2006;21(2): 224-8.

9Tommaso LD, Franchi G, Park YN,etal. Diagnostic value of HSP70, glypican-3 , and glutamine synthetase in hepatocellular nodules in cirrhosis〔J〕. Hepatology, 2007; 45(3):725-34.

10Silverstein AM, Grammatikakis N,Cochran BH,etal. P50(cdc37)binds directly to the catalytic domain of Raf as well as to a site on hsp90 that is topologically adjacent to the tetratricopeptide repeat bingding site〔J〕. J Biol Chem, 1998; 273 (32):20090-5.

11De la Rosa EJ, Veqa-Nunez E, Morales AV,etal. Modulation of the chaperone heat shock cognate 70 by embryonic (pro) insulin correlates with prevention of apoptosis〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA, 1998;95(17): 9950-5.

12Buzzard KA, Giaccia AJ, Killender M,etal. Heat shock protein 72 modulates pathways of stress-induced apotosis〔J〕.J Biol Chem,1998;273(27):17147-53.

13Long J ,Lang ZW, Wang HG ,etal. Glutamine synthetase as an early marker for hepatocelluar carcinoma based on proteomic analysis of resected small hepatocelluar carcinomas 〔J〕.Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2010;9(3):296-305.

14Sakamoto M. Early HCC: diagnosis and molecular markers 〔J〕.J Gastroenterol, 2009; 44(Suppl 19):108-11.

15Dal Bello B, Rosa L, Campanini N,etal. Glutamine synthetase immunostaining corrlelates with pathologic features of hepatocellular carcinoma and better survival after radiofrequency thermal ablation〔J〕. Clin Cancer Res, 2010;16(7):2157-66.