S期激酶相關蛋白2及細胞周期抑制蛋白p27在老年甲狀腺癌患者癌組織中的表達及臨床意義

嚴 麗

(河北醫科大學第二醫院腺體外科，河北 石家莊 050000)

甲狀腺癌是最常見的內分泌惡性腫瘤，占人類所有惡性腫瘤的1%～2%〔1〕。近年來甲狀腺癌在我國的發病率呈上升趨勢，以每年3%的增長速度遞增〔2〕。隨著甲狀腺癌規范性診療指南的推廣與應用，其復發/轉移率和病死率有所降低〔3〕。細胞周期的調控失衡被認為是腫瘤發生的共同特征，導致腫瘤細胞無限制、自主的增殖和分裂〔4〕。G1/S是一重要細胞周期調控點，p27是該調控點的一重要負性調控因子，屬于細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子，能阻止細胞進入S期。S期激酶相關蛋白(Skp)2也是細胞從G1期進入S期的必需因子，能特異性地識別以p27為代表的細胞周期負性調控因子，并促使其多聚泛素化及降解，使細胞周期從G1期進展至S期，促進細胞增殖〔5〕。因此，Skp2可通過降低p27蛋白的表達，從而參與細胞周期的調控，并參與調控細胞信號轉導，與多種腫瘤發生、發展關系密切〔6〕。本研究擬觀察Skp2和p27蛋白在甲狀腺癌中的表達及意義。

1 資料與方法

1.1臨床資料 2011～2013年我科首次就診的老年甲狀腺癌患者85例，納入標準如下：①甲狀腺癌經病理學確診；②未進行過放療或化療；③無其他惡性腫瘤病史。男29例，女56例；年齡60～72歲，平均(65.42±4.82)歲；均為乳頭狀癌；腫瘤大小<2 cm 23例、2～4 cm 26例、>4 cm 36例；腫瘤TNM分期Ⅰ期28例、Ⅱ期25例、Ⅲ期21例、Ⅳ期11例；無組織侵犯53例、有周圍組織侵犯32例；無淋巴結轉移40例、有淋巴結轉移45例。另外選擇同期經病理學確診的甲狀腺腺瘤和結節性甲狀腺腫老年患者各40例,3組年齡和性別差異均無統計學意義(P>0.05)。得到本院倫理委員會批準，并且患者均知情同意。

1.2主要試劑 鼠抗人Skp2蛋白多克隆抗體、鼠抗人p27蛋白多克隆抗體、胃蛋白酶抗原、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)免疫組織化學試劑盒及二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒均由北京博奧森生物技術公司提供。

1.3方法 所有標本取出后立即用10%甲醛溶液固定后常規石蠟包埋。石蠟標本連續切片，經常規脫蠟、水化，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3×5 min，胃蛋白酶抗原于37℃修復5 min，PBS沖洗3×5 min；3%過氧化氫處理10 min以抑制內源性過氧化物酶活性，檸檬酸鹽緩沖液中微波抗原修復，滴加鼠非特異性免疫血清，濕盒內室溫下孵育20 min，滴加Skp2和p27一抗，37℃孵育60 min后4℃下過夜，室溫下孵育20 min；PBS沖洗3×5 min；滴加生物素標記的二抗，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗3×5 min；加DAB顯色液，自來水沖洗，蘇木素復染，0.1%鹽酸分化，自來水沖洗，PBS沖洗3×5 min；梯度乙醇脫水干燥，中性樹脂封片。

1.4結果判定 Skp2蛋白主要表達于淋巴細胞細胞質，出現棕黃色顆粒為陽性。p27主要表達于細胞核內，胞質可有少量表達，出現棕黃色顆粒為陽性。根據綜合染色強度和陽性細胞所占百分率進行平均半定量進行評分。染色強度評分標準：0分為無色；1分為黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。陽性細胞率評分：光鏡下每張切片選取5個有代表性的高倍視野(400倍)，每個高倍視野選定中央測量區作為計數區域，計算測量區內陽性細胞百分率，陽性細胞數<5%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為2分；>50%為3分。兩種評分得分相加，0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～6分為中等陽性()，>6分為強陽性()〔7〕。

1.5統計學分析方法 使用SPSS13.0 統計軟件進行t檢驗和χ2檢驗及Spearman等級相關分析。

2 結 果

2.1各組Skp2蛋白表達的比較 甲狀腺癌組Skp2蛋白陽性表達率顯著高于甲狀腺瘤組和甲狀腺腫組(χ2=15.319，P=0.000；χ2=17.362，P=0.000)，甲狀腺腺瘤組和甲狀腺腫組Skp2蛋白陽性表達率差異無統計學意義(χ2=0.056，P=0.813)，見圖1和表1。

2.2各組p27蛋白表達的比較 甲狀腺癌組p27蛋白陽性表達率顯著低于甲狀腺腺瘤組和甲狀腺腫組(χ2=32.663，P=0.000；χ2=33.527，P=0.000)，甲狀腺腺瘤組和甲狀腺腫組p27蛋白陽性表達率差異無統計學意義(χ2=0.157，P=0.692)，見圖1和表1。

圖1 各組Skp2、p27蛋白的表達(×400)

表1各組Skp2、p27蛋白表達的比較〔n(%)〕

與甲狀腺癌組比較：1)P<0.001

2.3Skp2蛋白在甲狀腺癌中的表達與臨床病理的關系 Skp2蛋白的表達與腫瘤分期、周圍組織侵犯情況及淋巴結轉移有關(P<0.05或P<0.01)，而與性別和腫瘤大小無關(P>0.05)。見表2。

2.4p27蛋白在甲狀腺癌中的表達與臨床病理的關系 p27蛋白的表達與腫瘤分期、周圍組織侵犯情況及淋巴結轉移情況有關(P<0.05或P<0.01)，而與性別和腫瘤大小無關(P>0.05)。見表3。

2.5甲狀腺癌組織中Skp2蛋白和p27蛋白表達的相關性分析 甲狀腺癌組織中Skp2與p27蛋白表達評分呈正相關(r=0.657，P=0.016)。

表2 Skp2蛋白在甲狀腺癌中陽性表達與臨床病理的關系

表3 甲狀腺癌p27蛋白陽性表達與臨床病理的關系

3 討 論

甲狀腺癌的發病率在世界范圍內呈上升趨勢，也是發病率增速最快的腫瘤〔8〕。目前我國甲狀腺癌的發病率居腫瘤發病率第10位，總發病率為4.21/10萬，占內分泌相關腫瘤的第一位〔9〕。甲狀腺癌最初臨床多表現為無痛性甲狀腺結節，最重要的生物學行為是浸潤包膜和包膜外組織發生淋巴結轉移，容易轉移到頸部軟組織、頸部淋巴結、縱隔淋巴結等。由于甲狀腺癌復發率較高，致使其不可治愈性和死亡率增加〔10〕。隨著分子生物學的研究進展，腫瘤已被認為是一個多基因多信號通路參與調節的復雜的分子過程，以細胞增長和增殖失控為特征，表現為細胞周期調控的紊亂。細胞周期調定點以G1/S期調控檢測點最為重要，正調控因子可促進細胞通過調定點，而負調控因子則抑制細胞通過調定點。

Skp2是泛素連接酶復合物中DNA復制所必需的一種F-box蛋白，是細胞從G1期進入S期的必需因子。Skp2能夠特異性識別第187位蘇氨酸(Thrl87)磷酸化的p27，并介導其多聚泛素化及降解，促進細胞周期從G1期進展至S期，從而導致細胞過度生長、惡性增生和腫瘤形成〔11〕。既往的研究結果表明，Skp2在人類的許多癌組織如過表達，并且與腫瘤的分化程度有關〔12～15〕。在非小細胞肺癌的實驗研究表明，Skp2與腫瘤大小、淋巴結轉移、脈管內癌栓、臨床分期及組織學分級顯著相關〔16〕。而在鼻咽癌患者中95%以上可檢測到Skp2表達，Skp2高表達預示易向遠處轉移〔17〕。顯然，Skp2是一種與細胞周期有關的腫瘤原癌基因，多種腫瘤中明顯表達增高并與預后不良明顯相關〔18〕。因此，Skp2可能與腫瘤細胞生長、擴散有關。p27是一個重要的候選抑癌基因，是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白家族的重要成員，在控制細胞G1/S期檢查點中具有重要作用。p27基因定位于染色體12p13，由2個有編碼功能的外顯子編碼，相對分子質量為27 000。p27作為細胞周期G1期的負向調控因子，負性調節細胞增殖，一直以來都被視為候選的抑癌基因〔19〕。p27表達缺失使腫瘤細胞容易跨過G1/S期檢查點從而誘導細胞惡性增殖，其蛋白表達水平異常及功能異常與多種腫瘤的發生發展有關。p27低表達已被認為與腫瘤預后不良及高侵襲性密切相關〔20〕。p27表達有3種調節機制，包括p27啟動子的轉錄水平調節、p27 mRNA翻譯水平調節和蛋白質降解調節。經研究〔11〕證實，p27的蛋白表達水平主要受轉錄后機制的調節，其中由Skp2介導的泛素-蛋白酶體途徑是p27蛋白降解的重要途徑。p27又稱激酶抑制蛋白，是KIP家族一員，近年來的研究發現，p27基因及其產物主要通過細胞周期G-S節點的抑制來抑制細胞增殖，具有腫瘤抑制功能〔21〕；p27的異常表達與胃癌、肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌等腫瘤的發生、發展有著密切的關系〔22〕。本研究結果說明Skp2蛋白在甲狀腺癌組織中高表達，而p27在甲狀腺癌組織中表達缺失，提示Skp2和p27蛋白參與甲狀腺癌的發生及發展。

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