巴戟天糖鏈對骨骼肌成肌細胞向心肌樣細胞分化的影響

于 爽 察雪湘 吳 瑤 馮國清

(鄭州大學基礎醫學院藥理學教研室，河南 鄭州 450052)

巴戟天糖鏈是巴戟天醇提物水溶性部分中的主要有效成分，研究發現在經典成骨誘導組(地塞米松、維生素C和β-甘油磷酸鈉)中使用巴戟天水提取物和巴戟天醇提取物含藥血清能顯著促進骨髓基質細胞向成骨細胞分化作用〔1〕。但巴戟天寡糖對成肌細胞增殖分化的研究，目前尚未見報道。本實驗研究巴戟天糖鏈誘導成肌細胞分化為心肌樣細胞的作用及機制。

1 材料與方法

1.1動物、藥品與試劑、儀器 新生1～3 d SD大鼠(合格證號：410116)，雌雄不限，由河南省實驗動物中心提供。巴戟天(購自廣東省德慶縣藥材公司，一等品，河南省藥品檢驗所李杰鑒定) 生藥15 kg 粉碎后，分次用體積分數為0.70的乙醇在90℃水浴中煮60 min，將乙醇提取液旋蒸回收乙醇，得濃縮液。用適量的蒸餾水稀釋后，分別用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，棄去乙醚、乙酸乙酯、正丁醇可溶部分，得到醇提物的水溶部分，用層析柱方法分離收集糖鏈部分，其純度為98.76%。Desmin抗體由武漢博士德公司出品；PCRKit(AMV)Ver.2.1試劑盒由TaKaRa 公司出品；200 bp DNA Ladder Marker；GATA-4、β-actin引物由上海生工公司合成。HERA cell二氧化碳培養箱(德國GmbH公司)，PCR擴增儀(Sigma公司)；數碼凝膠圖像處理系統(UVI公司)。

1.2方法

1.2.1乳鼠后肢骨骼肌成肌細胞的培養〔2〕無菌條件下剪取SD大鼠后肢骨骼肌，剪成1～2 mm3的碎塊，用含抗生素的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次靜置1 min并棄上層液。加入濃度為0. 05 %的Ⅱ型膠原酶，37 ℃消化約40 min，1 000 r/min離心10 min，棄上清，再加入0.125%胰蛋白酶，37 ℃消化30 min，立即加入少許PBS液中止消化， 1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入PBS液輕輕吹打，100目尼龍網過濾，收集濾液。1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養基重懸。經重懸的細胞移入培養瓶中，高密度接種，置37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱。90 min后，吸出上層液，離心計數，以1×105/ml細胞密度接種于25 cm2培養瓶中，放入培養箱靜置培養。實驗采用培養的原代成肌細胞。

1.2.2成肌細胞鑒定 用Desmin 抗體對分裂增殖4～5 d的成肌細胞進行間接免疫酶染色。

1.3實驗分組 分空白對照組、5-氮雜胞苷陽性藥對照組(10 μmol/ml)、巴戟天寡糖大、中、小(500、300和100 μg/ml)劑量組。

1.4觀察各組成肌細胞對異丙腎上腺素(IP)的反應 取各組中具有自主跳動的成肌細胞(融合的細胞團)視野，分別觀察加入IP前后(IP終濃度為0.1 μmol/ml)各組多個視野下搏動的細胞團，并計數細胞團每分鐘搏動的頻率(次/min)。

1.5RT-PCR法檢測各組成肌細胞心臟轉錄因子GATA-4 mRNA的表達 Trizol提取細胞總RNA，參照TaKaRa PCR Kit(AMV)Ver.2.1試劑盒提供的條件進行逆轉錄，外引物序列：上游5'- AATCTCGATATGTTTGATGAC - 3' ；下游5'- GCTGCTGTGCCCATAGTGAG - 3' ;擴增片段長度528 bp。內引物序列上游：5' CCTCTCCTGTGCCAACTGCC - 3' 下游：5'- GCTGCTGCTGCTGCTGG - 3'； ;擴增片段長度272 bp。巢式PCR擴增GATA-4：第一輪引物反應條件：94℃ 2 min，擴增條件：94℃ 變性1 min,57℃退火1 min,72℃延伸2 min，25個循環。72℃，5 min,最后降至4 ℃取出，-20℃保存。第二輪引物反應條件：94℃ 2min，擴增條件：94℃ 變性1 min,63℃退火1 min,72℃延伸2 min,共30個循環。延伸條件：72 ℃，5 min,最后降至4℃取出，-20℃保存。選用β-actin作內參，上游5'- AGG TGA GAG GGA AAT CGT GCG - 3'；下游 - 3'-CGTG TCA CGA CAG ACC GTG-5',擴增片段長度299 bp，反應條件：預變性：94℃ 2 min， 擴增條件：94℃ 變性30 s,51 ℃退火45 s,72℃延伸40 s。共32個循環。延伸條件：72℃，7 min,最后降至4℃取出，-20℃保存。擴增產物于1.5%瓊脂糖凝膠行水平電泳，電泳條件：電壓5 V，30 min，溴乙錠顯色，用凝膠成像分析儀(UVI)觀察分析電泳結果。

1.6統計學方法 采用SPSS16.0統計學軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1成肌細胞的鑒定 將分裂增殖4～5 d的成肌細胞用Desmin 抗體進行間接免疫酶染色,成肌細胞desmin 胞質呈陽性反應,細胞核外周及胞質呈棕黃色;表明培養的細胞為成肌細胞。見圖1。

圖1 成肌細胞Desmin抗體染色陽性細胞 (×400)

2.2巴戟天糖鏈對IP誘發的成肌細胞自主搏動反應的影響 結果表明：各組成肌細胞搏動對IP均有反應，表明IP對成肌細胞有正性變時作用。與空白對照組相比，IP對巴戟天糖鏈小劑量組成肌細胞正性變時作用不明顯(P> 0.05)；而IP對巴戟天糖鏈中劑量組和巴戟天糖鏈大劑量組成肌細胞正性變時作用更加明顯(P<0.05)。與陽性藥組相比，IP對巴戟天糖鏈中劑量組和巴戟天糖鏈大劑量組成肌細胞正性變時作用更明顯(P<0.05)，提示巴戟天糖鏈具有誘導成肌細胞向心肌樣細胞分化的潛在可能。見表1。

表1 巴戟天糖鏈對IP誘發的成肌細胞自主搏動反應的影響

1：GATA-4(巴戟天糖鏈500 μg/ml)；2：β-actin(巴戟天糖鏈500 μg/ml)；3：GATA-4(巴戟天糖鏈300 μg/ml)；4：β-actin(巴戟天糖鏈 300 μg/ml)；5：GATA-4(巴戟天糖鏈 100 μg/ml)； 6：β-actin(巴戟天糖鏈 100 μg/ml)；7：GATA-4(空白對照)； 8：β-actin(空白對照)；9：GATA-4(5-氮雜胞苷10 μmol/ml)；10：β-actin(5-氮雜胞苷10 μmol/ml)；11： Marker

2.3巴戟天糖鏈對大鼠成肌細胞GATA-4 mRNA表達的影響 巢式PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，可分別于272 bp (GATA-4) 、299 bp(β-actin)見到條帶(圖2)，與設計引物相符。半定量RT-PCR結果提示: 空白對照組成肌細胞，未見GATA-4 mRNA的表達；而陽性藥對照組及巴戟天糖鏈的小、中、大劑量組均出現了GATA-4 mRNA的表達(0.51±0.04、0.67±0.11、0.84±0.06、1.02±0.08)；與陽性藥對照組相比，巴戟天糖鏈小、中、大三個各劑量組均可明顯上調GATA-4 mRNA的表達(P<0.05)，并隨劑量增加表達增強。

3 討 論

心肌梗死后存活心肌細胞數量下降而導致最終的心功能不全已成為心肌梗死患者預后死亡的主要原因。細胞移植技術，為心肌壞死區的細胞重建及衰竭心臟的功能恢復，提供了一種全新的治療策略〔3〕。骨骼肌成肌細胞是首先被應用于臨床試驗、并在臨床試驗中研究最多的移植細胞〔4〕。

本實驗結果提示：巴戟天糖鏈具有誘導成肌細胞向心肌樣細胞分化的潛在可能。原因在于巴戟天寡糖刺激了成肌細胞膜上“β受體”的表達，從而增強了成肌細胞對IP的反應。如進行心肌內移植時，巴戟天糖鏈誘導后的成肌細胞可望改善心肌的收縮性，加強心臟的收縮力。但如何解決成肌細胞自主收縮頻率與心肌細胞的差異，有待進一步研究。

GATA家族是含有鋅指結構的一組轉錄因子，具有結合核酸共同序列(A/T)GATA(A/G)的特性。其中GATA-4是目前研究較多的與心臟發育密切相關的轉錄因子，參與了心臟正常發育、功能基因表達的過程。GATA-4是某些心肌特異性基因的高效轉錄激活因子，也是心肌特異性基因時序性表達過程中一個關鍵的調控因子〔5〕。在胚胎發育中，可以在心肌祖細胞中檢測到GATA-4的表達。

巴戟天寡糖可誘導成肌細胞出現心臟轉錄因子GATA-4 mRNA的表達，并成一定的劑量相關性。巴戟天寡糖誘導成肌細胞分化過程中，可能發揮了某些心血管方面的藥理活性，使得誘導分化后的細胞可表達GATA-4 mRNA，其機制可能是通過細胞外信號調節激酶使GATA-4磷酸化，或者是通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3-kinase)激活通路來激活GATA-4，使GATA-4轉錄活性增高〔6〕。巴戟天寡糖誘導成肌細胞是否有GATA-4蛋白的表達，是否有心臟其他特有的轉錄因子的表達，有待進一步深入研究。

4 參考文獻

1王和鳴，王 力，李 楠. 巴戟天對骨髓基質細胞向成骨細胞分化影響的實驗研究〔J〕. 福建中醫學院報，2004；14(3)：16-20.

2黃桂林，李龍江，謝文楊. 新生SD大鼠成肌細胞體外培養的實驗研究〔J〕.實用口腔醫學雜志，2003；19(1):16-8.

3Hagege AA,Carrion C,Menasche P,etal. Viability and differentiation of autologous skeletal myoblast grafts in ischaemiccardiomyopathy〔J〕.Lancet,2003;361(9356):491-2.

4Pagani FD,DerSimonian H,Zawadzka A,etal. Autologous skeletal myoblasts transplanted to ischemia-damaged myocardium in humans histological analysis of cell survival and differentiation〔J〕. J Am Coll Cardiol,2003;41(5):879-88.

5Grepin C,Nemer G,Nemer M. Enhanced cardiogenesis in embryonic stem cells overexpressing the GATA-4 transcription factor 〔J〕. Development,2003;124(21):2387-95.

6Alisi A,Spaziani A,Anticoli S,etal. PKR is a novel functional direct player that coordinates skeletal muscle differentiation via p38 MAPK/AKT pathways〔J〕. Cell Signal,2008;20(3):534-42.