黨參水煎劑對亞急性衰老模型小鼠胸腺自由基代謝和細胞凋亡的影響

侯 茜 郭 美 張 帆

(甘肅中醫學院生物教研室 甘肅中醫學院系統生物學與中醫藥轉化研究所 甘肅中醫學院中西醫結合基礎學科重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

免疫系統的衰老是機體衰老的主要原因〔1〕。而免疫衰老是以胸腺衰老為先導的從中樞到外周的衰老進程，胸腺衰老可以作為免疫衰老最重要的標志〔2〕。因此，在抗衰老研究中，保護胸腺，延緩胸腺萎縮具有不可替代理論和實際意義。胸腺細胞過度凋亡是胸腺萎縮的重要因素〔3〕，而活性氧自由基與細胞凋亡密切相關〔4〕。黨參主治脾肺虛弱，氣短心悸，食少便溏，熱病傷津，虛喘咳嗽，內熱消渴等癥，可以作為人參的替代品〔5〕。現代研究發現，黨參具有增強免疫力、抗氧化、抗缺氧、抗疲勞、抗腫瘤、增強記憶和提高學習能力等功能〔6〕。目前，關于黨參延緩免疫衰老的研究還未見報道。現代研究已證實，D-半乳糖可以誘導免疫衰老，是有效的免疫衰老研究模型〔7〕。本實驗通過觀察黨參水煎劑對亞急性衰老模型小鼠胸腺組織大體形態結構、組織自由基代謝和胸腺細胞凋亡率方面的影響，研究其抑制胸腺萎縮，延緩免疫衰老的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級昆明種小鼠100只，雄性，2月齡，體重(20±2)g，購自甘肅中醫學院實驗動物中心。

1.2藥品試劑及儀器 黨參：產自甘肅文縣，經甘肅中醫學院藥學系晉玲教授鑒定為優質道地藥材。制成含生藥濃度為1 g/ml的水煎劑，置4 ℃備用；D-半乳糖：上海中秦試劑有限公司，批號20111220；維生素E軟膠囊：青島雙鯨藥業有限公司，批號110608；考馬斯亮藍蛋白濃度、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號111203；其余試劑均為國產分析純試劑。BS224S電子天平：賽多利斯科學儀器有限公司；Feb-80臺式高速離心機：金壇市恒豐儀器廠；OLYMPUS BX60光學顯微鏡：JAPAN；VIS-723N可見分光光度計：北京瑞克分析儀器公司；EPICS XL流式細胞儀：美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3動物分組 小鼠隨機分為5組，空白對照組、衰老模型組、維生素E組、黨參低劑量組和黨參高劑量組，每組20只。

1.4造模及給藥 每日每只小鼠頸背部皮下注射5%D-半乳糖溶液，注射量為1 000 mg/kg，空白對照組注射等量生理鹽水，共42 d。從造模第11天開始黨參高、低劑量組每日上午分別按相當于生藥量15 g/kg和5 g/kg灌服黨參水煎劑，維生素E組灌胃給予維生素E溶液50 mg/kg，空白對照組和衰老模型組給予等量生理鹽水灌胃。按體重調整給藥量，連續30 d。

1.5觀察指標與測定

1.5.1光鏡觀察胸腺組織病理變化 采用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速剖取胸腺，取一葉胸腺立即投入10%甲醛溶液中固定。取固定好的胸腺組織經石蠟包埋、切片、HE染色后，鏡下觀察組織大體形態變化。

1.5.2胸腺組織MDA含量及SOD活性的測定 采用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速剖取胸腺，去除周圍脂肪組織，預冷生理鹽水洗凈血液，吸干水分并稱重，加9倍體積的預冷生理鹽水，采用手工勻漿法制成10%的胸腺組織勻漿，操作在冰水浴中進行，3 000～4 000 r/min離心10 min，取適量上清液，按試劑盒說明進行操作。按公式計算出各組小鼠胸腺組織蛋白濃度、MDA含量及SOD活性。

1.5.3胸腺組織細胞凋亡率的測定 采用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速剖取胸腺，用PBS漂洗除去血液，將組織置于培養皿內，加適量PBS，用眼科剪剪碎，加0.25%Trypsion-EDTA溶液等體積與組織混合，室溫下攪動10～20 min，過200目尼龍網，將細胞懸浮于含1%胎牛血清的PBS中，混勻，1 000 r/min 離心5 min，去上清，將細胞重新懸浮于含1%胎牛血清的PBS中，再經PBS洗1次后將細胞懸浮起來，用加樣器將細胞懸液打入75%冷乙醇中混勻封口，置于4 ℃冰箱中固定12 h。然后取出，1 500 r/min離心5 min，PBS洗2次，加RNAase(0.5 mg/ml)消化，37 ℃ 30 min，加入PI(25 μg/ml)染色，避光20 min，流式細胞儀檢測，計算G0/G1期之前的A0峰(凋亡峰)，以峰值面積計算凋亡量。

1.6統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1黨參水煎劑對胸腺組織形態的影響 空白對照組：胸腺皮質與髓質分界清晰，皮質較厚，胸腺細胞排列整齊，網狀細胞較少；髓質染色淺，淋巴細胞較少而稀，上皮網狀細胞較多而顯著，可見胸腺小體。衰老模型組：胸腺皮質與髓質分界不清，皮質較薄，胸腺組織中脂肪顯著增加，局部出現纖維化，細胞排列紊亂，胸腺細胞明顯減少。維生素E組：胸腺組織形態接近空白對照組，皮質與髓質界線明顯，皮質較厚，胸腺細胞數量明顯增加。黨參低劑量組：胸腺組織形態介于空白對照組與衰老模型組之間，皮質與髓質分界較明顯，部分區域皮質較薄，胸腺細胞排列不齊，數量減少。黨參高劑量組：胸腺組織形態接近空白對照組，與維生素E組類似，皮質與髓質分界明顯，皮質較厚，胸腺細胞數量明顯增加。見圖1。

2.2黨參水煎劑對亞急性衰老小鼠胸腺組織MDA含量和SOD活性的影響 與空白對照組比較，衰老模型組和黨參低劑量組小鼠胸腺MDA含量顯著增高(P<0.05)，SOD活力下降(P<0.05)；與衰老模型組比較，維生素E組、黨參低劑量組和黨參高劑量組小鼠胸腺MDA含量顯著下降(P<0.05)，SOD活力顯著增加(P<0.05)；與維生素E組比較，黨參高劑量組MDA含量和SOD活力值無明顯差異(P>0.05)，黨參低劑量組介于維生素E組和衰老模型組之間。見表1。

衰老模型組

維生素E組

黨參低劑量組

黨參高劑量組

與空白對照組比較：1)P<0.05；與衰老模型組比較：2)P<0.05

2.3黨參水煎劑對亞急性衰老小鼠胸腺組織細胞凋亡率的影響 與空白對照組〔(1.34±0.28)%〕比較，衰老模型組胸腺細胞凋亡率顯著增加〔(14.91±0.83)%，P<0.05〕，維生素E組、黨參低劑量組和黨參高劑量組凋亡率有下降趨勢〔(3.38±0.36)%、(4.90±0.32)%、(3.85±0.23)%〕但與空白對照組相比亦有顯著差異(P<0.05)；與衰老模型組比較，各組小鼠胸腺細胞凋亡率均明顯降低(P<0.05)；與維生素E組比較，黨參高劑量組無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

自由基又稱游離基，是在體內氧化代謝過程中產生的，它作為一種氧化劑，對生物大分子如蛋白質、脂類、核酸等均有破壞作用，還可通過改變血液流變特性，引起微循環障礙導致局部缺血，使細胞處于缺氧狀態而受損〔8〕。同時，機體內存在自由基抗氧化酶防御系統，及時清除產生的自由基，保持體內自由基的產生和清除始終處于動態平衡。但當機體抗氧化酶活性下降時，體內產生的自由基得不到及時的清除，進而導致退行性疾病、腫瘤及衰老等現象的發生。

細胞凋亡是保持自身組織穩定、調控自身細胞的增殖和死亡之間的平衡、由基因控制的細胞主動性死亡過程〔9〕。細胞凋亡對衰老的影響主要表現在：一是通過凋亡的形式清除功能障礙或受損的細胞，并由纖維組織代替，維持機體內環境的穩定；二是清除不可再生的細胞，清除后不能由其他組織替代，進而導致病理改變。因此，細胞凋亡增加將導致組織細胞數量減少，功能減退而出現老年性進行性病理過程〔10〕。胸腺細胞凋亡率增加是影響胸腺萎縮的重要因素之一。

自由基與細胞凋亡有著密切的聯系。在諸多凋亡的誘因中，體內代謝或外源性因素產生的自由基均被證實可誘導細胞凋亡，大量研究表明自由基參與了細胞凋亡過程〔4〕。自由基代謝失衡和細胞凋亡過度均是影響衰老的重要因素。

本實驗結果表明，黨參水煎劑可通過改善胸腺組織病理形態、平衡自由基代謝和降低細胞凋亡率幾方面起到延緩胸腺萎縮，增強機體免疫功能，延緩衰老的作用。胸腺組織自由基代謝恢復平衡狀態可能是細胞凋亡率降低的影響因素之一。

4 參考文獻

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3龔張斌.胸腺衰老與免疫衰老〔J〕.國外醫學·老年醫學分冊，2009；30(4):145-9.

4王新玲，李彩月，侯穎春.自由基、細胞凋亡與衰老關系的研究進展〔J〕.中國老年學雜志，1999；19(4)：252-3.

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9Vaux DL.Toward and understanding of the molecular mechanism of physiological cell death〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:786.

10Warner HR,Hodes RJ,Pocinki K.What does cell death have to do with aging〔J〕.Am Geriatr Sec,1997;45(1):140.