MPTP對C57BL/6小鼠腦內kappa受體表達的影響

王冬梅 趙 丹 殷盛明 李盛龍 徐 紅 傅 雷 宮得正 于德欽 孟 旭

(大連醫科大學機能實驗室，遼寧 大連 116044)

帕金森病(PD)是中老年人常見的進行性中樞神經系統退行性疾病，其臨床表現為靜止性震顫、運動遲緩、肌肉僵直、步態紊亂及體位不平衡等〔1，2〕。此病主要病理特征為黑質多巴胺能神經元缺失及胞質內路易小體出現。PD的確切病因目前還不清楚，一般認為與多種因素有關，包括遺傳、環境、衰老等。近年來研究發現,PD不僅與黑質紋狀體系統多巴胺含量減少有關,可能也與阿片受體在中樞神經系統中代謝障礙有關。有關kappa受體表達異常是否參與MPTP小鼠的發病機制尚未見報道。為進一步探討本病的發病機制,以C57BL/6小鼠皮下注射MPTP成功誘發PD模型，觀察不同腦區的kappa受體表達的改變，探討MPTP對 C57BL/6小鼠腦內kappa受體免疫反應的影響。

1 材料和方法

1.1動物分組 選取健康C57BL/6小鼠(大連醫科大學動物實驗中心提供)，24只，雌雄各半，體重18～22 g，隨機分為模型組(MPTP+NS)、對照組(NS+NS)。模型組每日上午11∶30皮下注射MPTP(溶于三蒸水，pH8.5)20 mg/kg,連續8 d，對照組給等量生理鹽水，連續8 d。

1.2免疫組織化學實驗 動物經4%水合氯醛(400 mg/kg,i.p.)麻醉，1%和4%的多聚甲醛灌流，取腦放入4%的多聚甲醛中固定，含30%蔗糖的磷酸鹽緩沖液(PBS)中4℃過夜，切取50 μm厚的冠狀腦片，PBS漂洗10 min×2，與1%BSA孵育30 min；加入第一抗體(kappa-Ab，1∶100)4℃孵育過夜，PBS漂洗10 min×2；分別與相應的生物素化羊抗兔二抗(1∶400)室溫振蕩孵育1 h，PBS漂洗10 min×2；與卵白素化生物素復合物A∶B ∶PBS(1∶1∶400)室溫振蕩孵育2 h，二氨基聯苯胺(DAB)法顯色。空白對照腦片第一抗體以PBS代替。HPIAS系列彩色病理圖文分析系統定量計數kappa受體陽性細胞。選取模型組和對照組小鼠各5只。測量框的面積為3 120.4 μm2(43.1 μm×72.4 μm)，選取四個部位計數，取平均值。計算測量框內免疫反應陽性神經元細胞的個數。

1.3Western印跡法檢測實驗動物腦內kappa受體蛋白表達含量的改變 動物經4%水合氯醛(400 mg/kg,i.p.)麻醉，取腦，每50～100 mg腦組織加Trizol 1 ml，勻漿；加0.2 ml氯仿搖勻，離心15 min；有機相(大約0.8 ml)中加異丙醇1.5 ml混勻，室溫靜置10 min，4℃離心10 min，棄上清，用含0.3 mol/L鹽酸胍的95%乙醇溶液洗滌沉淀20 min×3次，每次洗滌后4℃離心5 min。真空干燥10 min，用1%SDS溶解沉淀(50℃，3 h)，4℃離心10 min，上清移新管，分光光度計595 nm波長測定蛋白含量；SDS-PAGE電泳，硝酸纖維素膜轉膜，加一抗(kappa受體抗體1∶100)，4℃過夜后TTBS洗10 min×3，加二抗，37℃ 1 h，TTBS洗10 min×3，加DAB顯色，適時終止反應，干燥、包存。干燥纖維素膜用數碼相機拍照后，用凝膠分析系統(上海天能公司生產)定量分析kappa受體蛋白含量。

1.4統計學方法 采用SPSS10.0軟件進行方差分析。

2 結 果

模型組與對照組比，在腦內海馬CA1區、額葉皮層區(Fr)和門區(Hilus)，單位面積內kappa受體免疫反應陽性細胞的數目明顯減少，kappa受體免疫反應陽性細胞的平均灰度明顯較低，而且kappa受體免疫反應陽性細胞排列紊亂，見圖1，表1，表2。

表1 小鼠相關腦區kappa免疫反應陽性細胞的數目

表2 小鼠相關腦區kappa免疫反應陽性細胞的灰度

Western印跡法蛋白表達結果顯示，模型組與對照組比，海馬和皮層處kappa受體蛋白(0.14±0.03、0.15±0.01)表達明顯低于對照組(0.17±0.02、0.26±0.03,P<0.05)，見圖2。這些結果均提示 kappa受體在MPTP處理后的C57BL/6小鼠腦內表達明顯減少，kappa受體表達的減少參與了PD的發病機制。

圖1 小鼠相關腦區kappa受體免疫反應染色結果(Bar=100 μm)

1：對照組海馬；2：模型組海馬；3：對照組額葉皮層；4：模型組額葉皮層

3 討 論

PD是一種常見中老年的基底節神經元進行性退行改變，主要累及黑質及黑質-紋狀體多巴胺遞質系統，以靜止性震顫、運動遲緩、肌肉僵直等運動障礙為特征，此時病人黑質多巴胺能神經元喪失通常可達50%～60%，紋狀體多巴胺減少可達60%～80%〔3，4〕。PD的發病包括①有致病因素存在的無病期；②PD病理過程已開始但無臨床癥狀的臨床前期；③出現PD典型臨床癥狀的臨床期。PD患者從發病到臨床診斷的時間通常為2～3年，很難借助臨床資料深入研究早期PD。早期PD動物模型，制備方法成熟，可重復性高，可模擬人類PD早期病理特征，所以有極大的優勢。MPTP被吸毒者誤用后產生了在生化、病理和臨床特征上酷似PD的表現。MPTP模型已成為研究PD發病機制、神經生化、病理解剖、運動及精神障礙、藥物作用等方面的最佳工具，并觸發了人們對環境毒素(除草劑、殺蟲劑)在PD致病作用中的研究。

MPTP本身不具有神經毒性，但可以穿越血腦屏障，并主要在星形膠質細胞和5-羥色胺能神經元內的單胺氧化酶B作用后轉變為有毒性的MPP+，然后釋放到細胞外，不能穿越血腦屏障，而是經由多巴胺轉運體(DAT)進入多巴胺能神經末梢和胞體，選擇性破壞黑質多巴胺能神經元，導致黑質細胞體、紋狀體神經末梢、多巴胺遞質的大量減少。單胺氧化酶B或DAT特異性抑制劑、DAT基因缺失等能抵抗MPTP的毒性作用；相反，高表達DAT可導致MPTP毒性增強。

近年來研究發現,阿片肽類物質代謝障礙也參與PD錐體外系癥狀的產生機制，關于阿片肽變化與多巴胺代謝障礙之間的關系,經動物實驗發現腦啡肽和內啡肽可使動物出現運動不能、肌張力增高和肌僵直等現象,阿片受體拮抗劑納洛酮可逆轉腦室內注射所致的運動不能等癥狀,而L-多巴也可逆轉肌張力增高和肌僵直,提示阿片肽與PD的多巴胺代謝障礙存在某種聯系。

已有報道說明Kappa受體相關的通路參與PD的發生〔5〕，給予PD大鼠Kappa受體激動劑時，其PD癥狀有所緩解〔6〕的功能，其中1/3紋狀體阿片受體位于多巴胺能神經元上，余2/3位于紋狀體或由紋狀體發出的神經元上〔7〕。雖然已有文獻報道，能與kappa受體特異性結合的強啡肽能夠隨著劑量的改變而對PD模型中的多巴胺能神經元有損傷、保護作用〔8〕，其機制是否與kappa受體有關，尚不清楚。本研究提示kappa受體的表達參與PD的發生，kappa受體蛋白表達明顯降低很可能就是PD發病的重要環節，支持了相關報道，在治療中給予kappa受體激動劑能夠緩解PD癥狀〔9〕。因此,進一步探討PD與kappa受體之間的關系,以尋求更有效的緩解PD的治療方法,可能會為此類疾病治療開辟新途徑。

4 參考文獻

1Schmidt N，Ferger B.Neurochemical findings in the MPTP model of Parkinson's disease〔J〕.J Neural Transmiss，2001;108(11)：1263-82.

2Robinson S，Freeman P，Moore C，etal.Acute and subchronic MPTP administration differentially affects striatal glutamate synaptic function〔J〕.Exp Neurol，2003；180(1)：74-87.

3Rousselet E，Joubert C，Callebert J，etal.Behavioral changes are not directly related to striatal monoamine levels，number of nigral neurons，or dose of parkinsonian toxin MPTP in mice〔J〕.Neurobiol Dis，2003;14(2)：218-28.

4Tillerson JL，Miller GW.Grid performance test to measure behavioral impairment in the MPTP2 treated mouse model of parkinsonism〔J〕.J Neurosci Methods，2003;123(2)：189-200.

5Lei F,Yue L,Dezheng G,etal.Protective effects of nicotine on gamma-aminobutyric acid neurons and dopaminergic neurons in mice with Parkinson disease〔J〕.Fron Med Chin,2009;3(3):330-5.

6王聰杰,牛 平,陳 鑫,等.白藜蘆醇對帕金森病大鼠黑質多巴胺能神經元損傷的保護作用〔J〕.中國醫科大學學報，2012；41(1):28-41.

7杜衛東,許洪升,孫中武,等.Mμ阿片受體基因(OPRM1)A118G多態性可能是散發原發性帕金森病一個潛在的易感位點〔J〕.中華疾病控制雜志，2010；14(3):187-91.

8Wang Q,Shin EJ,Nguyen XK,etal.Endogenous dynorphin protects against neurotoxin-elicited nigrostriatal dopaminergic neuron damage and motor deficits in mice〔J〕.J Neuroinflammation，2012;13(9):124.

9Newman DD,Rajakumar N,Flumerfelt BA,etal.A kappa opioid antagonist blocks sensitization in a rodent model of Parkinson's disease〔J〕.NeuroReport，1997；8(3)：669-72.