先天伏寒鼠模型的制備

郭家娟 張 爽 李亦男 黃永生

(長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，吉林 長春 130021)

黃永生教授在多年的臨床診治過程中，發(fā)現非常多的患者存在頑固性的足涼或手足涼的癥狀，這些患者通常會在不同年齡段規(guī)律性出現相似的病癥〔1，2〕，針對這種證候的規(guī)律性，同時基于前人伏邪理論及《靈樞·天年》的理論假說〔3〕，創(chuàng)立先天伏寒病因學說，總結出先天伏寒證的病因病機及癥候特點，提出診治方案，組方用藥應用于臨床，取得滿意的療效。以此為基礎，本課題組前期已完成“973計劃中醫(yī)伏邪病因學說的整理與創(chuàng)新研究”，初步規(guī)范了先天伏寒證的概念和診療，并證實臨床辨證時如果能夠針對先天伏寒病因特點進行治療，會明顯提高臨床療效。同時，課題組初步探索了先天伏寒的微觀生物學指標，推測先天伏寒證候的亞健康人群具有潛在性炎癥紊亂，同時還伴有神經內分泌系統(tǒng)功能低下。但因為臨床上病人從先天不足、伏寒于內到臨床發(fā)病，可能需要幾十年的時間，所以目前深入研究先天伏寒致病的微觀機制有一定難度。鑒于此，本實驗以制備穩(wěn)定的先天伏寒動物模型為目的，試圖為先天伏寒病因理論提供科學依據。

1 材料與方法

1.1動物 4周齡雌性、雄性Wistar大鼠各25只，體重(23±2)g；正常6周齡10只Wistar大鼠，體重(30±2)g，雌雄各半。實驗鼠均由吉林大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK-(J)2011-0003。

1.2藥物 氫化可的松注射液(批號：13031011)，天津藥業(yè)焦作有限公司。

1.3試劑及儀器 FAIO04電子分析天平，上海精密科學儀器有限公司；酶聯免疫檢測儀，南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司；京立LDZ5-2離心機，北京醫(yī)用離心機廠；TH-212智能數字測溫儀，北京鴻鷗成運科技有限公司。

1.4方法

1.4.1給藥及分組方法 氫化可的松腹腔注射，每只3.6 mg/100 g，連續(xù)14 d；同時附加寒冷因素：將大鼠分別置于2℃～4℃的冰水中游泳，5 min/次，1次/d，共14 d，制備腎陽虛大鼠模型。通過模型評估，證明成功的腎陽虛模型大鼠20只，雌雄各半。另取正常的6周齡Wistar大鼠10只，用摸球法隨機平均分配至正常雄加陽虛雌組，陽虛雄加陽虛雌組，陽虛雄加正常雌組，每組5對，分別同籠產子。

1.4.2一般狀態(tài)觀察 先天伏寒癥候表現類似腎陽虛，但其程度較腎陽虛更重〔1〕。一般狀態(tài)觀察包括體溫，反應靈敏度，活動情況，體重變化，體態(tài)，皮毛光澤度，豎毛現象，是否怕冷，是否喜歡擁擠在一起，飲食、大小便情況等，并與腎陽虛大鼠的一般狀態(tài)進行對比。

1.4.3指標測定 主要檢測大鼠下血腦-垂體-腎上腺(HPA)軸相關指標，包括皮質醇(Cortisol)、促腎上腺皮質(ACTH)、三碘甲狀原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、促甲狀腺激素(TSH)。

2 結 果

2.1各組大鼠一般狀態(tài) 在同籠產子過程中，陽虛雄加陽虛雌組從同籠開始到乳鼠產下平均耗時48 d，遠長于正常雄加陽虛雌組和陽虛雄加正常雌組的平均耗時34 d，且陽虛雄加陽虛雌組有2對沒有產子。先天伏寒鼠相比同周齡腎陽虛鼠體重稍有減輕，飲食減少，皮毛光澤度更差，豎毛現象更加明顯，反應靈敏度下降，喜歡擁擠在一起相互取暖。

2.2四組大鼠生長至4周齡時口腔、上肢、下肢溫度比較 新生鼠的口腔溫度，上、下肢溫度與腎陽虛大鼠及正常大鼠比偏低(P<0.01)。腎陽虛大鼠與正常大鼠比較下肢溫度有顯著差異(P<0.01)，口腔溫度和上肢溫度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。3組新生鼠口腔溫度，上、下肢溫度之間對比差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3各組大鼠Cortisol、ACTH、T3、T4、TSH水平比較 先天伏寒大鼠血清Cortisol、ACTH、T3、T4、TSH水平比腎陽虛大鼠均降低(P<0.05)，其中陽虛雄加正常雌組Cortisol、T4水平降低顯著(P<0.01)。見表2。

表1 各組大鼠各部位溫度比較℃)

表2 先天伏寒鼠與腎陽虛鼠血清激素水平比較

3 討 論

本實驗利用先天伏寒證“男女媾精，陽氣不足，寒伏于內”的病機理論，從模型的母代入手，遵循先天伏寒證的形成原因制備動物模型，基本保持了與臨床上先天伏寒證形成的一致性，因此能夠較好反映先天伏寒證的實質。

本實驗用腎陽虛鼠同籠產子，分別為父輩或母輩單方陽虛和父輩母輩雙方皆陽虛。產子后通過觀察新生鼠體溫、體重、體態(tài)、皮毛光澤度、豎毛現象、是否怕冷、是否喜歡擁擠在一起、反應靈敏度、自主活動情況、飲食、大小便等中醫(yī)癥狀為主導，結合分子生物學指標，對先天伏寒大鼠進行評價〔4～6〕。結果顯示，先天伏寒證鼠體重比腎陽虛鼠低，增長速度更加緩慢，精神狀態(tài)更加萎靡，活動度差，豎毛現象更加明顯，飲水量增加，常喜歡擁擠在一起，常有稀便。

有研究顯示，先天伏寒證患者可表現為HPA 軸功能及潛性炎癥因子異常，其中炎性因子白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、高敏C反應蛋白(hs-CRP)水平均明顯升高，血清Cortisol、ACTH水平均下降，且下降程度較腎陽虛患者更明顯〔7，8〕。據此，我們推測先天伏寒鼠表現亦有相同趨勢。結果顯示，與同周齡腎陽虛鼠比較，先天伏寒鼠血清Cortisol、ACTH、T3、T4、TSH均降低，這是從分子生物學角度對模型組鼠一般狀態(tài)進行了解釋，從而確定先天伏寒動物模型制備成功。

另外，正常雄加陽虛雌組，陽虛雄加陽虛雌組，陽虛雄加正常雌組3組之間相互比較，大鼠的一般狀態(tài)及血清Cortisol、ACTH、T3、T4、TSH水平差異不明顯，但陽虛雄加陽虛雌組產子耗時長，產子數量少，不利于先天伏寒大鼠模型的復制，故推斷正常雄加陽虛雌或陽虛雄加正常雌的組合方式更加適合先天伏寒鼠模型的制備。

4 參考文獻

1黃永生，郭家娟.先天伏寒證理論內涵及其對臨床指導意義〔J〕.實用中醫(yī)內科雜志,2007;21(6)：3-4.

2崔英子，郭家娟，黃永生.從先天伏寒論治冠心病心絞痛126例臨床觀察〔J〕.中醫(yī)雜志,2010;51(6)：516-9.

3任繼學.伏邪探微〔J〕.長春中醫(yī)學院學報，2005;21(1)：4-7.

4沈自尹.腎陽虛證的定位研究〔J〕.中國中西醫(yī)結合雜志，1997；17(1)：50-2.

5周文江，姚菊芳.腎陽虛證大鼠模型的建立〔J〕.實驗動物與比較醫(yī)學，2007;27(4)：242-3.

6茍小軍，韓寶俠，王朝廷,等.腎陽虛證造模方法考察〔J〕.吉林中醫(yī)藥，2009;2(9)：814-5.

7崔英子.從“先天伏寒”論治冠心病及其與神經內分泌免疫相關因子關系的研究〔D〕.長春：長春中醫(yī)藥大學，2010.

8魏 巖.冠心病心絞痛先天伏寒證代謝組學的初步研究 〔D〕.長春：長春中醫(yī)藥大學，2011.