PPARγ、脂聯素抑制肝星狀細胞增殖

車媛梅 張 一 應 杰

(南昌大學第一附屬醫院傳染科,江西 南昌 330006)

肝纖維化是各種原因引起慢性肝損傷共有的病理改變，也是進一步向肝硬化發展的中間環節，其病理的中心環節是肝星狀細胞(HSC)表型轉換后產生大量細胞外基質。在肝纖維化發生過程中，過氧化物酶體增殖物液活受體(PPAR)γ衰竭是HSC轉分化的關鍵分子變化機制之一。研究表明脂聯素不但在脂質及葡萄糖代謝中具有作用，同時具有抗肝纖維化作用，是否PPARγ能上調脂聯素表達、協同抗纖維化目前研究甚少。本研究通過PPARγ激動劑和(或)拮抗劑作用于活化的HSC，在mRNA及蛋白質水平分析PPARγ與脂聯素表達的關系，及其對HSC增殖的影響，為肝纖維化治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1主要試劑 大鼠HSC-T6，上海中醫藥大學肝病研究所徐列明教授；羅格列酮購自瑞士Alexis公司；GW9662購自美國Sigma公司；兔抗大鼠PPARγ抗體及兔抗大鼠Adiponectin抗體購自武漢博士德公司；小鼠抗大鼠β-actin抗體、辣根酶標記山羊抗兔二抗、辣根酶標記山羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋公司；總RNA提取試劑盒及RT-PCR試劑盒購自北京全式金公司；總蛋白提取試劑盒購自普利萊基因技術有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自北京Solavbia公司。

1.2細胞培養 大鼠HSC-T6用含10%胎牛血清及濃度為100 U/ml雙抗的高糖DMEM培養液培養細胞，放于37℃、5%CO2及飽和濕度孵箱中培養，每天觀察細胞生長情況，隔天換液，待細胞生長至80%～90%密度時傳代。

1.3實驗方法

1.3.1分組 根據文獻報道的最佳濃度給藥〔1〕，分為羅格列酮組(10 μmol/L)，GW9662阻斷組(1 μmol/L)，羅格列酮+GW9662組(10 μmol/L羅格列酮 + 1 μmol/L GW9662)，空白對照組(單純用含10%FBS的高糖DMEM培養液培養細胞)。

1.3.2MTT法檢測各組對HSC-T6細胞增殖的影響 取對數生長期細胞，胰酶消化后培養24 h，棄凈培養液，按照實驗分組加入藥物每孔200 μl；對照組用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養，每組設5個復孔，分別培養24 h后，加入無菌MTT溶液(5 mg/ml)20 μl及150 μl二甲基亞砜，振蕩10 min。采用492 nm波長，在酶標儀上測定各孔光吸收值(A值)，計算細胞的增殖率，增殖抑制率=〔(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值〕×100%。

1.3.3逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測PPARγ和脂聯素mRNA的表達 總RNA的提取及cDNA的合成按試劑盒說明書操作。引物由上海生物工程公司合成。PPARγ擴增片段222 bp，上游5′-3′CCC TGG CAA AGC ATT TGT AT,下游5′-3′ACT GGC ACC CTT GAA AAA TG;脂聯素擴增片段178 bp，上游5′-3′GTT CTC TTC ACC TAC GAC CAG,下游5′-3′GGA AGA GAA GAA AGC CAG TAA。參照 β-actin擴增片段522 bp，上游5′-3′TGG GAC GAT ATG GAG AAG AT下游5′-3′ATT GCC GAT AGT GAT GAC CT；擴增后電泳，凝膠成像系統掃描，脂聯素、PPARγ 與β-actin的比值為各自mRNA的相對表達水平，實驗重復3次。

1.3.4蛋白質免疫印跡(Western印跡)檢測脂聯素和PPARγ蛋白的表達 細胞中總蛋白提取按試劑盒說明書操作，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，用Umax2100XL掃描儀拍照，并用Quantity-One凝膠分析軟件分析目的條帶的灰度值，脂聯素、PPARγ 與β-actin的比值為各自蛋白的相對表達水平，實驗重復3次。

1.4統計學方法 應用SPSS17.0統計學軟件，采用Pearson相關分析。

2 結 果

2.1MTT法檢測HSC-T6細胞增殖的結果 GW9662組(0.893±0.027)、GW9662+羅格列酮組(0.779±0.027)及空白對照組(0.998±0.029)的A值均較羅格列酮組(0.678±0.029)明顯升高(t值分別為16.331、21.975、19.5，均P<0.01)。

2.2RT-PCR檢測HSC-T6細胞脂聯素和PPARγ mRNA表達 ①羅格列酮組脂聯素mRNA相對表達量(1.273±0.045)較空白對照組(0.693±0.065)、GW9662組(0.653±0.075)、GW9662+羅格列酮組(0.633±0.093)升高(t值分別為12.264、10.733、12.690，P<0.01)。②羅格列酮組PPARγ mRNA相對表達量(1.633±0.015)較空白對照組(0.457±0.015)、GW9662組(0.403±0.015)、GW9662+羅格列酮組(0.450±0.026)升高(t值分別為8.619、7.089、4.343，P<0.01)。③GW9662能同時阻斷羅格列酮對PPARγ及脂聯素mRNA的表達。④PPARγ和脂聯素mRNA表達有正相關關系(相關指數為0.970，P=0.000)。見圖1。

2.3Western印跡檢測HSC-T6細胞脂聯素和PPARγ蛋白表達 ①羅格列酮組(1.124±0.007)脂聯素蛋白相對表達量較空白對照組(0.734±0.043)、GW9662組(0.744±0.082)、GW9662+羅格列酮組(0.744±0.064)升高(t值分別為7.969、10.240、15.274，P<0.01)。②羅格列酮組PPARγ蛋白相對表達量(1.036±0.028)較空白對照組(0.649±0.005)、GW9662組(0.655±0.006)、GW9662+羅格列酮組(0.648±0.004)升高(t值分別為23.450、24.208、23.990，P<0.01)。③GW9662能同時阻斷羅格列酮對PPARγ及脂聯素蛋白的表達。④PPARγ和脂聯素蛋白表達有正相關關系(相關指數為0.966，P=0.001)。見圖2。

M：相對分子質量標準；A：羅格列酮組；B：GW9662組；C：羅格列酮+GW9662組；D：空白對照組；下圖同

圖2 Western印跡檢測HSC-T6細胞脂聯素、PPARγ蛋白表達

3 討 論

脂肪組織是一個活躍的內分泌器官，其分泌的細胞因子如脂聯素和瘦素參與肝纖維化發展。在病毒性肝炎及非酒精性脂肪性肝病研究中發現，脂聯素參與肝臟脂肪變、炎癥活動、纖維化〔2〕。Musso等〔3〕報道脂聯素水平與肝臟纖維化程度呈負相關。Kaser 等〔4〕報道各種病因的肝纖維化患者血漿脂聯素水平均明顯升高，且其血漿濃度與Child-Pugh 分級相關。Sohara等〔5〕報道38例肝硬化患者血清脂聯素水平與肝功能Child-Pugh分級呈正相關。Ding 等〔6〕在大鼠HSC培養過程中發現，靜息的HSC可以表達合成脂聯素，脂聯素可以減少增殖細胞核抗原的表達而抑制活化的HSC增殖及遷移，并促進活化的HSC 凋亡以抑制肝纖維化的發生發展。Adachi等〔7〕報道高分子量脂聯素通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑抑制HSC增殖。

近年來研究發現，PPARγ可通過多途徑、多層次維持HSC靜止表型，各途徑間有多種交互作用，形成錯綜復雜的信號調節網絡。研究發現，將生理濃度的脂聯素與人單核細胞來源的巨噬細胞共同孵育，脂聯素呈劑量依賴性地增加基質金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP)-1mRNA的表達，而PPARγ激動劑能誘導人巨噬細胞上脂聯素受體的表達〔8，9〕。本實驗結果說明羅格列酮激動PPARγ的表達，同時也上調脂聯素的表達，且這種激動作用可被特異性阻斷劑GW9662阻斷，提示羅格列酮的激動作用是通過PPARγ途徑實現的。相關性分析結果提示在HSC中細胞核內轉錄因子PPARγ與脂聯素的表達調控有一定相關，與文獻報道PPARγ的靶基因是脂聯素一致〔10〕。

綜上所述，本研究進一步證實脂聯素具有抑制肝纖維化的作用，其機制可能與PPARγ的轉錄與調控有關，通過提高PPARγ與脂聯素的表達，從而抑制HSC增殖，達到阻斷肝纖維化進展的目的。

4 參考文獻

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