堿性成纖維細胞生長因子、cAMP反應元件結合蛋白和Bcl-2在卵巢上皮性惡性腫瘤中的表達及意義

葉麗平 馬靜方 楊春雨 仇會會

(遼寧醫學院基礎醫學院，遼寧 錦州 121000)

卵巢癌是人體病理類型最多最復雜的惡性腫瘤,其發生發展與腫瘤的增殖及凋亡的失控有著密切關系。研究表明，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)激活的多種信號通路與腫瘤細胞增殖、凋亡及轉化等密切相關且bFGF可以顯著地促進卵巢癌的增殖，侵入和血管的發生，但其具體發生機制仍不明確。前期試驗表明，在卵巢癌中，bFGF可抑制無血清饑餓誘導的細胞凋亡;促進cAMP反應元件結合蛋白(CREB)及Bcl-2 mRNA及蛋白表達增加。本實驗探討CREB、bFGF和Bcl-2蛋白與卵巢惡性上皮性腫瘤發生的關系表達。

1 資料與方法

1.1病例資料和組織標本 收集2004年1月至2011年6月遼寧醫學院附屬第一醫院婦產科卵巢癌手術切除標本120例，患者年齡31～84歲。其中卵巢惡性上皮性腫瘤82例(漿液性囊腺癌26例，黏液性囊腺癌24例，子宮內膜樣囊腺癌 32例)；卵巢良性腫瘤組織20例，卵巢正常組織18例。所有患者術前均未接受放、化學或免疫治療，且均具有完整臨床資料。所有標本均經我院病理科確診。

1.2標本的處理 組織標本均用磷酸緩沖液配置的 10%中性甲醛固定液及時固后,進行乙醇梯度脫水，二甲苯透明以及石蠟包埋，4 μm厚連續切片。

1.3免疫組織化學實驗 (1)兔抗人bFGF多克隆抗體購自福建邁新工作液，兔抗人CREB多克隆抗體購自美國Abcam公司，兔抗人Bcl-2購自北京中杉工作液， SP超敏試劑盒購自北京中杉生物技術有限公司 按試劑盒說明書步驟進行染色，每次試驗均設陰性對照，用磷酸鹽(PBS)緩沖液代替一抗作為陰性對照，以公司提供的陽性片染色作為陽性對照。(2)實驗結果判斷：細胞內呈棕黃色顆粒狀為陽性表達，其中bFGF陽性表達位于細胞質，CREB陽性表達位于細胞核，Bcl-2陽性表達位于細胞質。評分方法：每張切片400倍顯微鏡下隨機選取 5個視野：①陽性細胞數：每個視野記數100個細胞，計算5個視野的陽性細胞的平均百分數分為4級：陽性細胞數1%～24% 為1分；25%～49%為2分；50%～74%為3分；大于75%為4分。②染色強度：無著色0分；淺黃色1分；黃或深黃色2分；褐或棕褐色3分，上述兩項相乘為分級標準：<4分定義為低表達，≥4分定義為高表達〔1〕。觀察結果由兩名病理科醫師采取盲法判斷。

1.4統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行t和χ2檢驗。相關性分析采用Spearman相關分析法。

2 結 果

圖1 bFGF、CREB和Bcl-2在卵巢癌中的表達(DAB，×200)

2.1CREB、bFGF和Bcl-2在卵巢惡性腫瘤、卵巢良性腫瘤和正常卵巢組織中表達 bFGF和Bcl-2陽性表達均定位于細胞質，CREB陽性表達位于細胞核(圖1)。在82例卵巢惡性腫瘤中，bFGF、CREB和Bcl-2分別有例57、62例和57例呈高表達；在20例卵巢良性腫瘤中，bFGF、CREB和Bcl-2分別有6例、8例和5例呈高表達；在18例正常卵巢組織中，bFGF、CREB和Bcl-2分別有2例、4例和2例呈高表達。bFGF、CREB和Bcl-2在卵巢惡性腫瘤組織中的表達明顯高于卵巢良性腫瘤、正常卵巢組織(P=0.000)。

2.2bFGF、CREB和Bcl-2蛋白表達與卵巢癌臨床病理學參數關系 bFGF、CREB和Bcl-2表達與腫瘤分期和淋巴結轉移有顯著的相關性，在分期較高，有淋巴結轉移者，bFGF、CREB和Bcl-2的表達明顯增高，其中bFGF的表達與組織的分化程度有關，但三者的表達年齡、腫瘤的組織學類型均無顯著的相關性。見表1。

表1 bFGF、CREB和Bcl-2蛋白表達與卵巢癌臨床病理學參數關系(n)

2.3bFGF、CREB和Bcl-2三者表達的相關性 在卵巢惡性腫瘤組織中，bFGF與CRER(r=0.426，P=0.000)、CREB與Bcl-2(r=0.673，P=0.000)和Bcl-2與bFGF(r=0.540，P=0.000)蛋白表達呈顯著正相關。

3 討 論

卵巢癌的發生發展與腫瘤的增殖及凋亡的失控密切相關。CREB是一種真核生物細胞核內調控因子，其功能表現在生命活動的許多方面,包括調節基因的轉錄、生理節奏、細胞的發育與生存、成癮性和抑郁以及學習記憶等〔2〕。bFGF可通過與其受體FGFR結合激活多種信號轉導通路，活化CREB調控多種基因轉錄,表現出多種生理功能，MEK/ERK及PI3K/PKB 信號轉導通路是由bFGF激活的經典信號通路,與腫瘤細胞增殖、凋亡及轉化等密切相關〔3，4〕。前期研究表明bFGF可快速激活人卵巢癌CAOV3細胞ERK活性，誘導CREB磷酸化以及抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達，并顯著抑制了無血清培養誘導的細胞凋亡，推測bFGF可能通過激活MEK/ERK1/2/CREB/bcl-2信號轉導途徑抑制卵巢癌CAOV3細胞凋亡〔5〕。

bFGF可以促進多種細胞的有絲分裂活動，而且可以促進血管內皮細胞的增殖。在腫瘤中，bFGF可以自分泌的方式促進有絲分裂和血管的發生〔6〕。因此bFGF的表達與多種腫瘤發生有關，如結直腸癌，卵巢癌等〔7，8〕。

近來研究發現CREB在許多惡性腫瘤發生發展中均扮演著重要的角色，如淋巴瘤，乳腺癌，黑素瘤和肝癌〔9〕。CREB高表達與細胞增殖和存活正相關,抑制CREB表達,可阻遏腫瘤細胞惡性增殖，增強化療藥物敏感性，前期研究結果也表明，RNA干擾降低CREB的表達可以降低卵巢癌細胞的增殖〔10〕，但在卵巢癌組織中CREB的表達情況研究較少。

眾多免疫組化研究結果均表明，在惡性腫瘤中，CREB的表達均比良性腫瘤及正常組織明顯增高，如結直腸癌非小細胞型肺癌，前列腺癌〔11，12〕，同樣，在卵巢癌中CREB的表達也比卵巢正常組織明顯增高〔13〕，與本研究結果一致。研究表明，在結直腸癌中，bFGF的表達與腫瘤的分期，分級，淋巴轉移有關，隨著分期和分級的增加，bFGF的表達增高〔7〕。在卵巢癌中，有研究表明，隨著FIGO分期及分級的增加， bFGF的表達增加〔8〕。本研究表明CREB在腫瘤的進展中起著重要的作用。

Bcl-2基因即B細胞淋巴瘤/白血病-2基因,其基因產物通過抵抗細胞凋亡,延長細胞壽命導致細胞數目增加,因此Bcl-2家族蛋白是多種腫瘤的存活因子，它的過表達與多種腫瘤的發生，進展，以及化療藥物的抵抗有關〔14〕。

研究表明，在惡性腫瘤中，Bcl-2的表達均比正常組織明顯增高，如胃癌，卵巢癌等〔15，16〕。并且發現在胃癌，卵巢癌中，Bcl-2蛋白的陽性表達均與腫瘤的分期有關，與年齡以及腫瘤的分化程度沒有關系〔15，16〕。與本研究結果一致。

在卵巢癌中，bFGF、CREB和Bcl-2的表達與腫瘤的臨床病理特征的關系一直存在爭議，這些研究之間的差異，一方面推測可能是統計的樣本量有差別；另一方面國際上沒有統一免疫染色的評分標準，搜集的病例不處于同一分期；另一方面可能由于應用免疫組織化學試劑、方法及實驗條件不同，這些都可能造成研究結果存在差異。但研究結果均表明，與卵巢良性腫瘤及正常組織相比,卵巢癌中bFGF、CREB和Bcl-2的表達均明顯增高。

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