液壓沖擊腦損傷大鼠炎性因子的表達及意義

張林會 李勝超 孫國柱

(河北醫科大學第二醫院神經外科，河北 石家莊 050000)

顱腦損傷包括機械性沖擊造成的原發性損傷和損傷后啟動的一系列生化過程引起的繼發性、進行性神經細胞損傷即繼發性腦損傷，前者具有不可預料性和難控制性，后者則是在首次損傷后啟動的包括一系列神經生化降解過程的損傷級聯反應〔1〕，炎性細胞因子大量激活并分泌，導致神經細胞變性、壞死，與顱腦損傷的過程及其預后密切相關〔2〕，但有關炎性細胞因子表達規律的報道較少。為此，本研究通過制作液壓打擊顱腦損傷模型，觀察腦組織含水量、組織學變化以及炎性細胞因子白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、ICAM-1表達的動態變化，探討炎性細胞因子在繼發腦損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 成年雄性SD大鼠48只，體重250～300 g，購于河北醫科大學實驗動物中心，兔抗鼠IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1多克隆抗體購于Sigma公司，兔二步法檢測試劑盒購于Santa Cruz公司，其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2動物分組和模型制作 將實驗動物隨機分為2組，其中模型組40只，再按照傷后1、6、12、24 h、3、7 d又分為5個亞組，每個亞組8只；假手術組共8只。采用Dixon法制作動物模型〔3〕。假手術組，僅切開頭皮，鑿骨窗，不行液壓打擊，余同上。喂養標準飼料和飲用純凈水，使用動物專用籠箱和潔凈墊料，恒溫20～25℃飼養。自由進食水。

1.3標本的制作和采集 假手術組在術后，模型各亞組在相應時間點，在氯胺酮過度麻醉下，4%多聚甲醛經心灌注,開顱取腦，以經過挫傷灶的橫線為基線，在基線前側取(200±50) mg腦組織用于測定腦組織含水量，取挫傷灶后(斷面跨挫傷灶)約4 mm厚的腦組織進行固定和石蠟包埋，獲得的組織切片行HE染色和免疫組織化學染色。

1.4干濕法測定腦組織含水量 所取標本先用濾紙吸除表面水分，置電子分析天平(分度值0.000 1 g)稱取濕重(W)，再經110 ℃ 恒溫烤箱烘烤24 h后稱取干重(D)。應用公式：腦組織含水量(%)=(W-D)/ W ×100，計算出腦組織含水量。

1.5免疫組化觀察AQP4表達 采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶免疫組化染色試劑盒進行染色。陰性對照分別用正常山羊血清和PBS代替IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1一抗作孵育，其余步驟同上。以細胞膜上出現棕黃色粗顆粒或棕黃色細膩顆粒為陽性結果。采用Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統進行圖像分析，以細胞平均光密度值(OD)表示IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1陽性表達的強弱。

1.6統計學方法 采用SPSS11.0軟件單因素方差分析，計算Pearson相關系數進行相關性分析。

2 結 果

2.1腦組織含水量 與假手術組(78.46±1.112)%比較，模型組1 h(77.94±0.762)%時無差異(P>0.05)，6 h時稍升高(79.11±1.276)%，12 h顯著升高(80.26±1.473)%，24 h至3 d達到高峰(82.74%±1.097%,82.04%±1.694%)，7 d時降低(80.72±1.866)%。

2.2IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1表達 IL-1β表達：與假手術組相比，模型組動物水腫腦組織的IL-1β表達6～12 h升高(P<0.05)，24 h至3 d達到高峰，至3 d開始下降，至7 d仍高于SO組。IL-6表達：與SO組相比，TBI組動物水腫腦組織的IL-6蛋白表達自傷后1 h開始升高，12 h持續增加，在傷后24 h到達高峰，傷后3 d至7 d后逐漸降低。TNF-α表達：TBI組動物水腫腦組織TNF-α表達從1h開始增高，6 h至12 h達到高峰，24 h 后逐漸下降，仍高于SO組。ICAM-1表達：與假手術組相比，模型組動物水腫腦組織ICAM-1表達自傷后6 h開始升高，傷后12 h仍繼續上升，24 h達高峰，3 d開始逐漸減低，7 d后仍高于SO組(P<0.05)，見表1，圖1。

表1 不同時間點IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1的表達變化

圖1 模型組各炎性因子表達(DAB，×400)

2.3組織學觀察 模型組大鼠傷后1 h可見挫裂傷灶結構破壞，點片狀出血，膠質細胞胞漿有空泡樣變。6 h挫裂傷灶組織崩解，其周圍神經膠質細胞變形及出現空泡樣變性，血管外間隙擴大。12 h神經膠質細胞空泡樣繼續增加。24 h膠質細胞胞漿空泡樣變更加明顯，數量增加；神經細胞胞體腫脹，胞質嗜酸性變，胞核固縮變形，偏心，且神經細胞及膠質細胞周圍水腫，間隙變寬。3 d大量神經細胞變性壞死，膠質細胞顯著增生，炎癥細胞浸潤。7 d壞死空洞由纖維組織填充，膠質細胞增生更加明顯，水腫有所減輕，炎癥細胞大量浸潤。假手術組動物光鏡下見腦組織結構完整，細胞排列有序，無損傷、水腫及出血，神經細胞類圓形，核仁藍色淡染，核膜完整。

2.4IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1表達和腦水腫的關系 線性回歸分析顯示：水腫腦組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1的表達與腦含水量之間呈正相關(r=0.805，r=0.763，r=0.927，r=0.866，均P<0.05)

3 討 論

本實驗說明炎性因子參與了繼發性腦損傷的病理發生發展過程。正常腦組織中炎性細胞因子表達輕微，但是創傷性顱腦損傷發生后，由于受到機械性創傷以及合并缺血、缺氧等病理因素的作用下，腦組織產生大量的炎性細胞因子，破壞血腦屏障，引起腦水腫，加劇繼發性損傷〔4,5〕。TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1被認為屬于促炎細胞因子，它們在顱腦損傷后以及腦水腫的早期短暫超量表達是造成繼發性顱腦損害的重要因素，甚至認為其表達水平可作為衡量顱腦損傷后繼發性炎癥反應程度的重要指標〔6～8〕。

TNF-α是損傷后較早期釋放的促炎細胞因子，具有多種生物效應，可以激活細胞因子級聯反應，誘導白細胞介素和次級炎癥介質的合成〔9〕，高表達時會產生嚴重的神經毒性，加速神經細胞的死亡〔10〕。IL-1β其過量表達一方面，通過滲透進入血管外組織中，活化的白細胞釋放大量的氧自由基和蛋白水解酶，損傷腦組織; 另一方面，白細胞的牢固黏附導致微血管阻塞，腦組織缺血缺氧，從而加重腦組織的損傷。其細胞因子IL-1β mRNA的表達與炎癥程度呈正相關〔11〕。

IL-6作為一種重要的炎性介質，在腦損傷中對中樞神經系統影響是雙向的。一方面在腦損傷的腦組織中顯著增高，能促使白細胞與內皮細胞黏附，引起內皮細胞損傷，增加血腦屏障的通透性，并產生氧自由基，引起神經細胞死亡，參與繼發性腦損傷的過程〔12〕，另一方面，IL-6也是一種具有神經營養和保護作用的因子。ICAM-1表達于血管內皮和白細胞表面，能夠調節白細胞的滲透、遷移，對中性粒細胞具有募集作用。研究發現腦脊液中可溶性ICAM-1濃度與CT顯示腦創傷范圍呈正相關性，其變化水平反映顱腦損傷程度，應用ICAM-1抗體或將ICAM-1基因剔除可降低腦卒中鼠模型淋巴細胞浸潤、減輕腦組織水腫及神經損傷程度，提高存活率〔13〕。

總之，損傷腦組織中 IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α均出現高表達，抑制炎性細胞因子表達可能有助于減輕繼發性腦損傷，改善預后。

4 參考文獻

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