15-脫氧前列素2抑制MG63細胞活性并誘導其凋亡的機制

全碧波 張善鋒 李月白 李曉坤 李嘯然 李 潔

(鄭州大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，河南 鄭州 450001)

骨肉瘤是骨組織最常見的原發性惡性腫瘤，約占所有骨腫瘤的20%。典型的惡性骨肉瘤具有顯著地局部侵襲性和早期遷徙能力〔1〕，由于其轉移病癥較難診斷，通常該病患死亡率較高。過氧化物酶體增殖因子活化受體(PPAR)γ的激動劑能誘導多種腫瘤細胞凋亡或分化，其作為人類癌癥的化學預防劑的潛在用途是目前研究的熱點〔2〕。本研究分析PPARγ激動劑15-脫氧前列素2(15d-PGJ2)對人骨肉瘤MG63細胞增殖和凋亡的影響，探討其抗腫瘤的作用機制。

1 材料和方法

1.1材料 人骨肉瘤細胞株MG63(北京協和細胞資源中心)；15d-PGJ2(美國Cayman公司)；胎牛血清(PAA公司)；胰蛋白酶(美國Gibco公司)；MTT、DMSO(美國Sigma公司)； RPMI 1640培養液(北京索萊寶科技有限公司)；DEPC(加拿大Fermentas公司)；AnnexinV-FITC試劑盒(南京凱基公司)；PCR擴增試劑盒 (加拿大Fermentas公司)；SP法免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋)；其余試劑均為國產分析純。

1.2細胞培養 常規細胞復蘇、換液和傳代，倒置相差顯微鏡觀察骨肉瘤MG63細胞的生長情況及形態學特征，取生長狀態良好的骨肉瘤細胞描記細胞生長曲線。

1.3實驗分組 以人骨肉瘤MG63細胞為作用對象，分為：對照組，不添加任何藥物；15d-PGJ2組，根據實驗加入其終濃度分別為0.1、1、5、10、20、50 μmol/L的15d-PGJ2。

1.4MTT法檢測細胞增殖活力 取對數生長期MG63細胞，以3×104/ml細胞濃度，接種96孔培養板，每孔200 μl，細胞貼壁后棄去培養液，加入不同濃度的15d-PGJ2，對照組不加藥，每組設6個復孔，空白對照組加入等量溶劑。分別孵育24 h、48 h、72 h及96 h，每孔加入MTT液20 μl(5 g/L)，4 h后棄去上清液，并加入DMSO 150 μl，終止反應。用酶聯免疫檢測儀在490 nm波長處測吸光度(A值)，并以空白對照孔的A值調零。生長抑制率(E)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。重復3次。

1.5流式細胞儀檢測細胞周期 取對數生長期細胞，制成單細胞懸液，以2×105/ml的濃度接種于75 cm2培養瓶中于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養，次日貼壁后加入終濃度分別為0.1、1、5、10、50 μmol/L的15d-PGJ2。培養48 h和72 h，收集2×106個細胞，70%冰乙醇固定，4 ℃冰箱過夜，次日檢測并對樣本進行細胞周期分析。

1.6AnnexinV/PI雙染色檢測細胞凋亡 將20 μmol/L 15d-PGJ2干預48 h的細胞制成單細胞懸液，計數取1×106個細胞置離心管內，2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 ml PBS緩沖液，重復上述操作。再加入500 μl的上樣緩沖液，輕輕震蕩使細胞懸浮，依次加入10 μl AnnexinV-FITC，5 μl碘化丙啶(PI)輕輕混勻，避光室溫反應15 min。隨即進行流式細胞儀檢測。

1.7逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測藥物干48 h PPARγ mRNA的表達 利用TRIzol法提取總RNA，嚴格按照RT-PCR試劑盒說明操作，分別以不同引物擴增PPARγ和內參照β-actin。各引物序列如下：β-actin上游，5'-AAG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3'；下游，5'-AGA AGG CTG GGG CTC ATT G-3'，擴增片段為176 bp；PPARγ上游，5'-CAG GAG CAG AGC AAA GA-3';下游，5'-GGA CTC AGG GTG GTT CA-3'，擴增片段為474 bp。PCR擴增條件為：95 ℃預變性3 min；95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，35次循環；72 ℃延伸10 min。取RT-PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以待測基因與相應內參照條帶面積灰度值比值作為mRNA相對表達量。

1.8免疫細胞化學檢測相關凋亡蛋白的表達 采用過氧化物酶標記的鏈霉卵白素(SP法)染色試劑盒，工作濃度為1∶200，按試劑盒說明進行操作。

1.9統計學方法 采用統計學軟件SPSS15.0進行方差分析和t檢驗，組間兩兩比較用Student-Newan-Keuls檢驗。

2 結 果

2.1生長曲線描記 培養過程中，骨肉瘤MG63細胞生長較為迅速，傳代后短期內處于潛伏適應期，隨后便進入對數生長期，細胞數目顯著增多，達到平臺期后，生長穩定，細胞分裂增殖速度逐漸變慢，最后直至衰老，細胞數目明顯減少。

2.2不同時間濃度的15d-PGJ2干預MG63細胞增殖的結果 同一濃度的15d-PGJ2對MG63細胞的生長抑制作用24 h與48 h比較有差異(P<0.01)，48 h、72 h及96 h時間范圍內隨著時間的延長其抑制率并無差異(P>0.05)。在各個時間點，任兩個濃度組兩兩比較的均有差異(P<0.05)，相同時間點的抑制率從0.1 μmol/L至50 μmol/L隨著藥物濃度的遞增而增加。其中在50 μmol/L濃度的抑制率幾乎達到100%(表1)。15d-PGJ2藥物對MG63的半數抑制率IC50為3.599 μmol/L。

表1 各濃度15d-PGJ2在不同時間對人骨肉瘤MG63細胞增殖的抑制率

2.315d-PGJ2干預人骨肉瘤MG63細胞周期的結果 ①不同濃度水平的各細胞周期分布差異有統計學意義(P=0.000)。在48 h和72 h時間點，G0/G1期、S期和G2/M期的細胞比例在5 μmol/L和20 μmol/L 15d-PGJ2兩個濃度組間均有差異(P<0.05)；在兩個時間點均顯示為用藥組G0/G1期細胞比例明顯高于對照組，S和G2/M期細胞比例明顯低于對照組，且隨藥物濃度的增加，G0/G1期比例有上升的趨勢；即藥物可使細胞周期G0/G1期阻滯。②不同時間點無差異(P>0.05)。見表2。

2.4AnnexinV/PI雙染色檢測細胞凋亡的結果 5 μmol/L 和20 μmol/L 15d-PGJ干預48 h，凋亡率分別為18.32%和32.08%，與對照組凋亡率(1.15%)比較差異顯著(P<0.05)。

2.5RT-PCR檢測藥物干預48 h PPARγ mRNA表達的結果 對照組和20 μmol/L 15d-PGJ2濃度組電泳條帶與相應的內參β-actin灰度值的比值分別為0.94±0.23和2.06±0.35，有統計學意義(P<0.05)(圖1)。

1：對照組；2：15d-PGJ2處理組；M:Marker

2.6免疫細胞化學技術檢測藥物干預后相關凋亡基因蛋白表達的結果 20 μmol/L 15d-PGJ2干預MG-63細胞48 h，加藥組caspase-3和Bax蛋白表達的陽性率(分別為126.46±3.83和135.36±6.72)明顯增高于對照組(86.46±3.73和97.08±3.84)(P<0.05)；而加藥組P53和bcl-2蛋白表達陽性率(分別為135.06±2.73，126.17±3.54)明顯低于對照組(163.29±4.67和181.34±5.76)(P<0.05)。

表2 各濃度15d-PGJ2作用48 h和72 h時人骨肉瘤MG63的細胞周期分布

3 討 論

PPARs是配體激活的轉錄因子，靶基因的轉錄激活依賴于配體與受體的結合〔3〕。其中15d-PGJ2是PPARγ的內源性天然配體，與該受體具有特異的親和作用。近期研究表明，PPARγ在乳癌、前列腺癌、肺癌等多種腫瘤細胞中都有表達，并且配體激活的PPARγ有抑制細胞增殖，誘發凋亡信號，誘導分化以及抗血管生成的作用〔4～6〕。本實驗采用結果表明，15d-PGJ2可使MG63細胞阻滯于G1期，抑制細胞DNA的合成，使S期細胞減少，阻止細胞進入M期，經有絲分裂而產生的子代細胞數減少，這與細胞增殖實驗的結果一致。本實驗結果顯示，一定范圍濃度的15d-PGJ2可誘導MG-63細胞凋亡，且具有明顯藥物濃度依賴性。本研究發現，15d-PGJ2可使PPARγ mRNA表達量明顯升高，同時凋亡相關基因caspase-3和Bax表達上調，由對照組不同程度的陰性或弱陽性變為陽性表達，而P53和bcl-2基因的表達下調，由對照組陽性表達轉為弱陽性或陰性表達。由此推測15d-PGJ2誘導骨肉瘤細胞凋亡可能與激活其受體PPARγ，誘導bcl-2/Bax比例的變化以及促進caspase-3的表達而促進腫瘤細胞凋亡的途徑有關。野生型P53可能通過上調Bax的表達誘導bcl-2/Bax比例的變化誘導細胞凋亡。綜上所述PPARγ的激動劑15d-PGJ2能夠通過抑制MG-63細胞的生長與增殖，通過細胞周期滯止與促凋亡進而達到抗腫瘤作用。人骨肉瘤MG-63細胞中PPARγ的高表達可能為骨肉瘤的預防與治療提供新的治療靶點。

4 參考文獻

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