人參皂甙Rg1對老齡腦缺血再灌注損傷大鼠腦功能的保護及谷氨酸、天冬氨酸含量的影響

周媛媛 李超彥 李 立

(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南 漯河 462002)

人參皂甙(GS)是人參的主要藥理活性成分之一，具有抗氧化、抗衰老和減輕神經(jīng)功能損傷的作用，作為中藥復(fù)方制劑的主要成分之一已應(yīng)用于腦血管疾病的治療〔1〕；但GS包含較多單體如Rb1、Rd、Re、Rg1、Rg3等，故對其單體藥理活性的研究顯得尤為重要〔2〕。目前缺血性腦血管病的實驗研究中多以青年動物為對象，忽視了人類腦血管疾病中年齡增長因素的重要性，對探討老年缺血性腦血管病病理生理特點及指導(dǎo)臨床防治方面有一定的不足。本實驗采用老齡腦缺血再灌注損傷(IRI)大鼠模型，研究GS單體Rg1對腦IRI大鼠腦功能的保護作用及谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)含量的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級Wistar大鼠，雌雄不拘，15月齡48只，體重350～390 g，由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供(合格證號：20110020)；GS Rg1由上海同田生物技術(shù)有限公司提供(批號：10110619)，使用前用生理鹽水按0.1ml/kg配成合適濃度后給藥；血栓通注射液由雅安三九藥業(yè)制藥有限公司提供(批號：1011009)；MSE-25型高速冷凍離心機(上海科學(xué)儀器廠)，電子天平(梅特勒AL10401)，超低溫冰箱(美國ThermoForma702)，Waters高效液相色譜儀(Waters公司)，721-分光光度計(上海第三分析儀器廠)。

1.2動物分組 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，自由飲食；隨機分為假手術(shù)組、模型組、低劑量、中劑量、大劑量GS Rg1組及血栓通組，每組8只。術(shù)前5 d腹腔注射GS Rg1低、中、高劑量分別為10、20、40 mg/kg，血栓通注射液0.45 mg/kg，造模前0.5 h靜脈給藥1次，造模后4 h和10 h分別再進行腹腔注射給藥。模型組及假手術(shù)組給以等量生理鹽水腹腔注射。

1.3動物模型制備 參照Longa等〔3〕方法建立大鼠中動脈阻塞模型。大鼠10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉后，沿頸部正中切開，分離右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈；用絲線結(jié)扎右頸總及頸外動脈，在頸內(nèi)動脈處預(yù)先打一松結(jié)；在右頸總動脈分叉處剪一V形缺口，將阻塞線由切口插入并輕推至頸內(nèi)動脈處，結(jié)扎預(yù)置的松結(jié)；隨后碘伏消毒，縫合皮膚。缺血2 h后，大鼠再次麻醉后，剪開切口，將阻塞線退出至頸內(nèi)動脈頸段以實現(xiàn)缺血后再灌注，消毒及縫合皮膚。

1.4造模成功標(biāo)準(zhǔn) 取造模大鼠側(cè)腦切片行2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色，變白色為模型成功。術(shù)后實驗動物出現(xiàn)左側(cè)眼瞼下垂，眼球凹陷，不能完全伸展左側(cè)前肢及行走時向左側(cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈。符合上述標(biāo)準(zhǔn)且存活24 h者作為實驗對象，立即進行行為學(xué)評分并取腦組織備用。

1.5行為學(xué)評分 按照Longa等〔3〕神經(jīng)功能缺損評分法評分。0分，無神經(jīng)損傷癥狀；1分，不能完全伸展對側(cè)前爪；2分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。神經(jīng)功能缺損評分時間點同上。

1.6腦梗死范圍測定 將造模后存活24 h大鼠，快速取出兩側(cè)大腦半球，冰凍20 min后于大腦中間取冠狀切面腦組織切片，置于TTC中，15 min后以4%甲醛固定。以BI2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計算腦梗死面積百分比。

1.7病理學(xué)檢查 大腦中間取冠狀切面腦組織切片，4%甲醛固定，脫水，石蠟包埋后切片，行HE染色。光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.8腦組織勻漿制備 取剩余大腦半球顳葉，制成10%腦組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液置-20℃冰箱備用。以高效液相色譜法學(xué)進行Glu和Asp含量測定。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1GS Rg1對大鼠腦梗死面積及神經(jīng)行為學(xué)評分的影響 與假手術(shù)組比較，模型組行為學(xué)評分顯著升高(P<0.01)，腦梗死面積顯著增大(P<0.01)；與模型組比較，GS Rg1中、大劑量組及血栓通注射液組行為學(xué)評分顯著降低(P<0.05)，腦梗死面積均顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 GS Rg1對大鼠腦梗死面積及行為學(xué)評分的影響

2.2GS Rg1對腦組織Glu、Asp含量的影響 與假手術(shù)組比較，IR 24 h后模型組Glu和Asp顯著升高(P<0.01)，與模型組比較，GS Rg1中、大劑量組及血栓通組Asp含量明顯降低(P<0.05)，GS Rg1中劑量組Glu含量明顯降低(P<0.05)，GS Rg1大劑量組及血栓通組Glu含量明顯降低(P<0.01)。見表2。

表2 GS Rg1對腦組織Glu、Asp含量的影響

2.3腦組織形態(tài)學(xué)改變 光鏡下可見假手術(shù)組腦組織無明顯缺血性病理改變，各類細胞胞質(zhì)胞核界限清晰；模型組腦組織缺血再灌注區(qū)域可見神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞出現(xiàn)腫脹變形，胞質(zhì)胞核界限不清，部分胞核固縮、核膜模糊核仁不清或者消失，細胞間質(zhì)疏松水腫、間隙變寬，可見少量炎癥細胞浸潤，呈現(xiàn)缺血性病理改變。各GS Rg1劑量組中隨劑量增大可見腦組織IRI程度明顯減輕，細胞核及細胞膜輪廓漸清晰，間質(zhì)水腫減輕。血栓通組腦組織光鏡變化可見類似于GS Rg1大劑量組的表現(xiàn)。

3 討 論

腦IRI涉及極其復(fù)雜的病理生理過程，其中各個環(huán)節(jié)、各種影響因素間的相互作用尚未完全闡明〔4〕。目前研究顯示缺血期間升高的Glu、Asp等興奮性氨基酸的興奮毒性在神經(jīng)細胞損傷及引發(fā)的腦功能障礙中起重要而關(guān)鍵的作用，缺血時間愈長，腦間質(zhì)Glu與Asp的峰值濃度愈高，神經(jīng)病理學(xué)和神經(jīng)功能學(xué)損傷愈嚴(yán)重〔5，6〕。因此檢測IRI后腦組織Glu與Asp含量的變化，可從側(cè)面反映IRI的損傷程度，而降低興奮性氨基酸含量可能是改善IRI的一個有效治療手段。

離體及在體研究表明人參具有滋補、抗疲勞、益智、抗癌等多方面作用；GS是人參的主要藥理活性成分，研究表明其可通過調(diào)節(jié)細胞膜蛋白離子通道而發(fā)揮多種藥理效應(yīng)〔1,7〕；Rg1是GS的一種單體及主要活性成分之一，作為小分子親脂性物質(zhì)而易于通過血腦屏障，其對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用及機制是目前研究的熱點〔8，9〕。已有研究表明GS Rg1可降低顱腦損傷大鼠神經(jīng)細胞的凋亡率達到腦保護作用〔10〕，通過抑制Bax表達，降低Bax/Bcl-2比值，從而減輕腦損傷；其效應(yīng)可能與通過清除氧自由基，增加抗氧化反應(yīng)而實現(xiàn)〔11〕；GS Rg1對海馬損傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶同樣有促進作用，可能同樣與其抗氧化作用相關(guān)〔12〕。隨著年齡的增長，機體內(nèi)氧化應(yīng)激水平逐漸升高，GS Rg1的抗氧化能力可減輕其對腦組織及血管造成的損傷，但其對腦IRI后是否存在保護作用及其機制，目前尚未明確。

本研究表明興奮性氨基酸參與了腦IRI和遲發(fā)性神經(jīng)損傷的發(fā)生發(fā)展。本研究還表明GS Rg1能改善老齡大鼠腦IR引起的腦組織功能損傷，其機制可能與其降低腦組織中Glu及Asp含量有關(guān)，從而減輕或限制了Glu、Asp等興奮性氨基酸的神經(jīng)興奮毒性。

4 參考文獻

1Zhang HA，Wang M，Zhou J，etal.Protective effect of ginsenoside against acute renal failure and expression of tyrosine hydroxylase in the locus coeruleus〔J〕.Physiol Res，2010；59(1)：61-70.

2Fuzzati N.Analysis methods of ginsenosides〔J〕.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2004；812(5)：119-33.

3Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989；20(1)：84-91.

4李 涵，陳 萌，孔祥玉，等.腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元損傷機制的研究進展〔J〕.承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2007；4(4)：413-5.

5楊 娜，隋 峰，姜廷良.神經(jīng)性疾病相關(guān)的谷氨酸轉(zhuǎn)運體研究進展〔J〕.中國實驗方劑學(xué)雜志，2011；17(7)：255-8.

6崔景斌，王俊萍，鄢文海，等.大鼠腦缺血再灌注損傷后興奮性氨基酸、NOS和NO的含量的變化〔J〕.鄭州大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2002；37(2)：169.

7Lee BH，Lee JH，Lee SM，etal.Identification of ginsenoside interaction sites in 5-HT3A receptors〔J〕.Neuropharmacology，2007；52(4)：1139-50.

8李麗艷，路新國.人參皂甙對心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)的影響及抗運動疲勞的作用〔J〕.中國臨床康復(fù)，2005；9(16)：196-7.

9劉紅梅，李瑞雪，楊學(xué)軍，等.人參皂甙的神經(jīng)保護作用和機制及其在神經(jīng)變性疾病中的應(yīng)用〔J〕.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009，31(5)：595-8.

10陳大慶，朱烈烈，李永領(lǐng)，等.人參皂甙Rgl對顱腦損傷模型大鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響〔J〕.實用醫(yī)學(xué)雜志，2010；26(1)：30-1.

11周洪霞，張作風(fēng)，張志勇，等.人參皂甙Rg1對大鼠肢體缺血再灌注后腦組織Bax和Bcl-2表達的影響〔J〕.解剖學(xué)雜志，2011；34(1)：55-7.

12陳志勇，杜天明，陳善成，等.人參皂甙Rg1對海馬電損傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能和海馬神經(jīng)細胞形態(tài)的影響〔J〕.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011；31(6)：1039-42.