機械力對血管內皮細胞一氧化氮合成的調控機制及致動脈粥樣硬化作用

李 慶 楊 漪

(石家莊市中醫院功能科，河北 石家莊 050051)

血流機械力變化導致的動脈粥樣硬化主要在于它破壞了血管內皮細胞和平滑肌細胞的一氧化氮(NO)生成的系統平衡〔1〕。本文重點討論血流機械力〔剪切力和環壁張力對內皮細胞NO的生成和NO合酶(NOS)〕表達的調控機制，并強調其介導血管內皮細胞的感染、氧自由基的產生及最終引發血管壁重建(主要是平滑肌細胞參與)的機制。

1 剪切力對血管內皮細胞NO生成及NOS表達的影響

1.1剪切力影響血管內皮細胞生成NO 單向的剪切力通過兩個機制影響血管內皮細胞生成NO。在剪切力開始作用后幾秒，NOS受刺激開始產生NO，與此同時，剪切力產生了一個短暫而強烈的細胞內鈣離子濃度的提高，隨之，高濃度的鈣調蛋白捆綁到NOS上并增強NOS的活性。當胞內鈣離子濃度提高到最大值后返回到剪切力刺激前的正常水平，NO的生成卻不斷提高，也就是說剪切力誘導的NO生成并不依賴于細胞內鈣離子濃度的改變。這個獨立的作用機制來源于NOS的特別位點的磷酸化作用，即磷酸化導致了電子從NOS的還原區域向酶的加氧區域移動〔2〕。磷酸化特別位點在NOS的第635和1 177個氨基酸(均為絲氨酸，由蛋白激酶A介導)〔3〕。幾小時以后，剪切力引發了NOS mRNA轉錄和相應的蛋白合成增加，結果是內皮細胞產生大量的NO〔4〕。這個NOS的上調表達包括兩個過程，一個是短暫的NOS mRNA轉錄的提高，一個是穩定的持續的NOS mRNA高表達〔5〕，前一個轉錄提高的信號轉導通路主要是先刺激絡氨酸激酶cSrc，而后再刺激Ras，Raf，MEK 1/2和Erk 1/2四個通路；后一個穩定過程主要是依賴cSrc通路，沒有絲裂原活化蛋白激酶(MAP)激酶通路參與。

2 剪切力對NOS mRNA轉錄的影響

剪切力刺激NOS mRNA 轉錄僅僅持續1 h左右。這個現象將會有巨大的生理學意義。如，簡單的身體鍛煉會提高人體內的NOS產量，進一步說，NOS mRNA短暫的高爆發表達類似一個藥物負荷劑量的作用，即通過提高 mRNA 穩定性，一個穩定狀態的NOS mRNA高表達將會持續出現。剪切力對NOS mRNA轉錄的調節主要是超激活NOS 刺激物(順勢作用元件)，這個刺激物在轉錄起始位點上游-984到-990之間〔6〕〔此區域包含剪切力反應序列5-￠CCAGAG-3￠〔7〕，超激活通過核因子(NF)κB結合到此位點來實現〕。此剪切力特別反應序列的突變將導致NOS 刺激物對剪切力刺激失去反應。NF-κB存在于細胞質，為一不活躍的三聚體(P50、P65、IκB三個獨立功能的活動區域)。當抑制性子亞單位IκB被其上游的激酶所磷酸化時〔8〕，它便與P65、P50分離，而后P65、P50依次轉位到細胞核，在這與相關基因的順勢作用元件同源物結合。有實驗表明，在NOS mRNA激活過程中，剪切力引發了P65、P50轉位并提高了二者的遷移速度，在NOS基因的順勢作用元件上存在剪切力反應序列，P65、P50將結合此序列上來完成上述剪切力刺激反應。值得強調的是，在NF-κB對NOS表達的影響過程中，NF-κB的激活將會提高與感染相關的基因的表達，這些基因包括血管內皮細胞黏附分子(VCAM)1、細胞內黏附分子(ICAM)1、組織因子、單核細胞趨化因子(MCP)1。上述感染相關基因參與了動脈粥樣硬化的形成似乎與NF-κB刺激NO生成而有抗動脈粥樣硬化形成的作用矛盾。最近研究顯示存在一個負反饋機制調節了剪切力依賴的NF-κB激活NO的瞬時生成過程〔9〕。相關實驗顯示、向內皮細胞體外補充NO將減弱剪切力對eNOS基因表達的促進作用及降低NOS表達刺激物的活性；相反，向內皮細胞體外補充NOS抑制劑將起到促進的作用。除了激活NF-κB，剪切力同時也提高介導NO生成的相關酶的活性。如前所述，NF-κB的激活導致P50/P65二聚體轉位到細胞核，在這里二聚物結合到NOS基因的順式作用元件而提高NOS mRNA的轉錄和NOS蛋白合成。P50的亞硝化作用將抑制其轉位〔10〕，以此限制NF-κB在細胞核內的活性，這個機制說明了是P50的亞硝化作用導致剪切力刺激下的NO大量生成返回到刺激前的水平。這個負反饋機制能用如下的實驗說明，用L-NG-硝基精氨酸甲酯抑制NO的生成將導致瞬間的P50向核內轉位，而轉位不受剪切力刺激的影響，相反，用突變的P50基因(相關蛋白缺乏亞硝化作用位點)轉染內皮細胞，內皮細胞會產生大量的NOS表達。無論內皮細胞是否會受到剪切力刺激，這個高表達不會減弱。以上結果說明在剪切力激活NF-κB、提高NOS表達、促進NO生成之間存在一個負反饋通路。在基本的非病理生理狀態下，正常水平的NOS蛋白決定了剪切力依賴的NOS基因順式作用元件的超激活的時間。如果NOS蛋白處在一個高水平狀態，在剪切力刺激后不久它就能夠催化生成足夠數量的NO來終止NF-κB的激活作用。如果NOS蛋白處在一個較低水平，NF-κB的活性將持續保持在一定水平，NOS mRNA的轉錄活性也會不斷提高，這足以使NOS恢復并保持在正常水平。在不正常的病理生理狀態下，這個負反饋的抑制作用方面將會改變，此時剪切力刺激會變成一個病理性的炎性刺激〔11〕。例如，NOS基因促進物的多態性能夠抑制剪切力依賴的NOS的轉錄，同理，在剪切力刺激下，NOS輔助因子四氫生物蝶呤(BH)4的缺乏能夠抑制NO生成和導致NF-κB活性持續保持。某些內生的NOS抑制物，例如非對稱的二甲基精氨酸，能夠抑制NO生成和不斷促進NF-κB的核轉位(在剪切力刺激下)。這些作用能夠導致一個剪切力刺激下持續內皮細胞感染的病理現象(而不是剪切力刺激下的抑制內皮細胞感染)。這些機制充分說明了剪切力刺激的NO生成是抑制內皮細胞感染的關鍵因素，而在缺乏NO狀態下，剪切力刺激卻是一個致感染因素。

2 環壁張力對血管內皮細胞NO的生成及NOS表達的影響

2.4內皮細胞內ROS含量的影響因素 NOS缺乏的高血壓小鼠體內ROS含量降低，暗示NADPH氧化酶和脫耦聯的NOS是血管內ROS不斷提高的重要源泉。雖然NOS缺乏的高血壓小鼠體內ROS含量明顯降低，但仍然保持一些，這個事實暗示在鼠內皮細胞和平滑肌細胞內，還有一些其他的生成ROS的資源，它包括黃嘌呤氧化酶、線粒體、細胞色素p450等，一個實驗已證實〔21〕，在NADPH氧化酶缺乏的小鼠內皮細胞內，ROS的生成沒有降低，而其對腫瘤壞死因子(TNF)-α和佛波醇酯的刺激反應降低。

2.5環壁張力與內皮細胞依賴的血管舒張機制的關系 研究提示〔22〕，在血管高張刺激下，NOS的脫耦聯也是血管內過氧化氫(H2O2)產物不斷生成的重要源泉，同理，抑制BH4的合成將導致內皮細胞依賴的血管舒張。有實驗〔22〕證實，在高血壓小鼠體內，eNOS酶的輔因子BH4氧化將導致BH4含量降低。

兩個機制導致了H2O2刺激血管舒張，一個機制是H2O2刺激過氧化氫酶并使之與鳥苷酸環化酶結合形成復合物〔23〕，隨之復合物刺激環磷酸腺苷大量生成。另一個機制是H2O2是一個內皮細胞依賴的超極化因子〔24〕。相比其他氧化物，H2O2是相對穩定的，能從一個細胞擴散到另一個細胞，在細胞內H2O2也有靶目標，因此，H2O2對血管平滑肌細胞的增生和肥大起著極其重要的作用。

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