噬菌體法檢測結核分枝桿菌及其耐藥性的研究

張永勝 張松巖

我國是耐多藥結核病患者人數最多的國家之一, 全國結核病耐藥性基線調查報告顯示, 我國結核分枝桿菌的初始耐藥率為28.1%, 繼發耐藥率為41.1%, 耐多藥結核病(MDR-TB)為8.32%［1］, 耐多藥結核病的情況很嚴重, WHO已將我國作為全球25個耐多藥結核病重點國家之一［2］。目前常規結核分枝桿菌藥敏試驗不能滿足患者和臨床需要。以噬菌體法進行結核分枝桿菌檢測及藥物敏感性試驗, 在結核分枝桿菌檢測和藥敏應用研究備受關注。本研究利用噬菌體法對71株結核分枝桿菌臨床分離株分別進行鏈霉素、利福平、異煙肼藥物敏感性進行分析, 觀察與比例法的符合率, 并對肺結核患者139份臨床痰樣本, 直接進行結核分枝桿菌檢測應用研究。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 71株結核分枝桿菌臨床分離株來自本所確診的肺結核患者的痰樣本培養物, 并經對硝基苯甲酸(PNB)鑒定為結核分枝桿菌；139份臨床痰樣本, 來自本所門診臨床確診的肺結核患者。

1.2 方法

1.2.1 本用NaCl-NaOH去污染, 用15 ml PhageTek MB Medi Plus沖洗, 37℃過夜。(菌液不用去污染, 藥敏試驗加入相應藥物, S、R孵育24 h, H孵育48 h, 藥物終濃度分別為S 1 μg/ml、R 2 μg/ml、H 0.2 μg/ml)

1.2.2 感染噬菌體 向標本中加100 μl噬菌體, 37℃孵育1 h。

1.2.3 殺死結核(TB)體外游離的噬菌體 向標本中加100 μl強效病毒劑, 充分震蕩, 靜置5 min。

1.2.4 中和 向標本中加5 ml Medium plus , 片刻靜置。

1.2.5 表達 向標本中加1 ml幫助細胞, 倒入瓶皿中, 加入5 ml融化的瓊膠(不易過熱50～60℃), 迅速旋轉混勻, 靜置,37℃過夜。

1.2.6 結果判定 0～19個菌斑 表明陰性結果, 說明標本中無活著的結核桿菌；20或更多菌斑 表明陽性結果, 說明標本中有活著的結核桿菌。藥敏結果的判定：藥敏培養基菌斑數<20或藥敏培養基菌斑數/對照培養基菌斑數<1%, 判定為敏感；反之判定為耐藥。

2 結果

2.1 應用 10例結核分支桿菌分別在 102、5×102、103、104、105cfu/ml濃度, (Mcfarland 3.0 濁度相當于細菌濃度107cfu/ml)進行噬菌體法檢測結核菌。該方法檢出最低濃度為 5×102cfu/ml。

2.2 噬菌體法結核分枝的特異性實驗, 銅綠假單胞菌、肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等呼吸道常見細菌應用噬菌體法檢測均為陰性。牛型分枝桿菌15株、結核分枝桿菌61株, 進行噬菌體法結核菌檢測均為陽性。(菌液濃度均為105cFu/ml)其特異性達到100%。

2.3 噬菌體法進行藥物耐藥性分析, 見表1。噬菌體法藥敏同比例法的符合率為90.2%, 分別為S 92.6%、 R 91.1%、H 88.6%。

表1 噬菌體法藥敏與比例法藥敏結果的比較(n, %)

2.4 肺結核患者臨床痰標本139株, 直接進行噬菌體法結核菌檢測。涂陽培陽標本該方法檢出率為96.2%, 涂陰培陽標本檢出率為80.0%, 涂陰培陰標本檢出率為26.2%。見表2。

表2 139例肺結核患者臨床痰標本的噬菌體法檢測結果(n, %)

3 討論

利用噬菌體法對結核分枝桿菌檢測和藥物敏感性實驗具有較高敏感性和特異性, 菌液濃度達到5×102cFu/ml就可檢測出來(涂片檢出濃度為104cFu/ml), 特異性達到100%；其藥物敏感性符合率較高(90.2%)；直接檢測肺結核患者痰樣本檢出率為62.6%, 大大高出涂片30%的檢出率；而藥物敏感性結果報告時間(2～4 d)明顯低于改良羅氏絕對濃度法的時間(2～3個月)。由上述研究結果可看出, 該方法是一種較理想、快速、具有較高敏感性和特異性檢測結核分枝桿菌和藥物敏感性新方法。

結核病細菌學快速檢查歷來是國內外學者所關注的熱門話題。在國外以分支桿菌噬菌體為基礎的結核分支桿菌的分類學、結核桿菌分子生物學、結核病診斷耐藥性分析和新藥篩選等已成為研究熱點［3］。其敏感性可與聚合酶鏈反應(PCR)媲美, 而且與培養法符率高。國內多家單位也相繼報道了噬菌體法檢測抗結核藥物藥敏的結果, 均顯示了較好的應用前景［4］。本實驗應用噬菌體法對鏈霉素、利福平、異煙肼進行藥物耐藥性分析。噬菌體法藥敏同比例法的符合率為90.2%,分別為S 92.6%、 R 91.1%、H 88.6%。與國內外報道基本相符。盡管噬菌體法檢測結核分枝桿菌和藥物敏感性實驗具有快速、敏感、特異等優點, 但廣泛應用于臨床, 還需在統一操作方法、權威性的結果判定標準、商品化試劑盒等方面進行進一步研究。

［1］ 陳影.噬菌體法檢測痰標本結核分枝桿菌及其耐藥性的研究,延邊大學, 2011.

［2］ World Health Organization.The Global MDR-TB ＆ XDR-TB Response Plan(2007-2008).Geneva:WHO, 2007:18.

［3］ 林健雄, 王冬敏, 彭東東, 等.噬菌體生物擴增法快速測定結核分枝桿菌卷曲霉素耐藥性的研究.中國防癆雜志, 2008,30(6):506-509.

［4］ 邊澤源, 何川, 涂少華, 等.噬菌體法直接檢測痰標本中結核分枝桿菌利福平耐藥性的研究.實驗與檢驗醫學, 2009, 27(6):145-146.