酸響應(yīng)聚合物-鉑共軛納米顆粒給藥載體的抑癌作用

梁濤

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，鄭州 450052)

順鉑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床治療各種癌癥，其藥理作用機(jī)制是阻止雙螺旋的解螺旋和分離，阻止細(xì)胞的分裂并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[1-3]。然而，65% ～98%的順鉑與血漿蛋白結(jié)合，導(dǎo)致藥物失活，降低順鉑治療效果[4-6]。另外，多數(shù)抗腫瘤藥物具有極高的生物毒性且缺少特異選擇性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)影響到正常對(duì)照組織細(xì)胞[7-10]。為提高藥物靶向性，筆者應(yīng)用酸響應(yīng)的聚合物-鉑共軛的納米體系，將順鉑負(fù)載聚合物納米顆粒(nanometer particle，NP)中[11]，合成具有酸響應(yīng)特性的藥物載體，在酸性環(huán)境的腫瘤部位下釋放出藥物，從而延長(zhǎng)藥物半衰期，并且可以同時(shí)遞送兩種或更多藥物用于聯(lián)合治療以便產(chǎn)生協(xié)同作用，并降低耐藥性[8]，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 羥基-聚乙二醇-聚肥酸共聚物(HOOCPEG-PLA-NH-NH2，參照文獻(xiàn)[12]合成)，四氯鉑酸鉀(K2PtCl4)以及其他用于化學(xué)合成順鉑的試劑購(gòu)買(mǎi)自Sigma-Aldrich，細(xì)胞培養(yǎng)試劑和培養(yǎng)液購(gòu)買(mǎi)自Media Tech，噻唑藍(lán)(thiazolyl blue，MTT)細(xì)胞增殖測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)普洛麥格公司。A2780人卵巢癌細(xì)胞由UCSD Moores癌癥中心Stephen Howell博士提供。

1.2 方法

1.2.1 合成 PtCl2(OCOCH2CH2COCH3)2(NH3)2首先按照文獻(xiàn)合成PtCl2(OH)2(NH3)2，之后用其合成PtCl2(OCOCH2CH2COCH3)2(NH3)2[13]。將過(guò)量的乙酰丙酸酐于回流下加入到含有PtCl2(OH)2(NH3)2100 mg(0.3 mmol)的丙酮溶液中，反應(yīng)12 h后，加入冷水水解過(guò)量的酸酐，將反應(yīng)混合物于2℃下放置16 h。在減壓下除掉丙酮，得到白色殘?jiān)瑢堅(jiān)謩e用水、乙醇和乙醚進(jìn)行洗滌而純化，得到最終產(chǎn)物，產(chǎn)率為39.0%。

1.2.2 聚合物-順鉑前體藥物共軛體Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)的合成 將HOOC-PEG-PLA-NH-NH2與PtCl2(OCOCH2CH2COCH3)2(NH3)2以劑量比1∶8溶解在二氯甲烷/N，N-二甲基甲酰胺溶液(體積比1∶1)30 mL中，于氮?dú)?N2)氛圍中50℃回流狀態(tài)下反應(yīng)48 h。將粗產(chǎn)物在乙醚中反復(fù)沉淀進(jìn)行純化，隨后用水和三氯甲烷進(jìn)行萃取。將得到的純化的Bi(PEGPLA)-Pt(IV)保存在－20℃?zhèn)溆谩Ｆ洚a(chǎn)率為28.3%。

所合成的共軛體Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)的核磁表征數(shù)據(jù)為:1H NMR(CDCl3，400 MHz):1.2(t，3 H，J=7.0 Hz)，1.55(m，3H)，2.1(s，3H)，2.9(d，2H，J=2.8 Hz)，3.47(q，2H，J=7.0 Hz)，3.63(m，2H)5.15(m，1H)，8.0(br，3H)，8.2(br，1H)。

1.2.3 聚合物-順鉑前體藥物共軛體NP的制備 NP通過(guò)納米沉淀的方法制得。將Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)共軛體10 mg溶解在乙腈3 mL中并在連續(xù)攪拌下加入到含水10 mL的小瓶中。當(dāng)納米沉淀完成后，將有機(jī)溶劑除去。之后將NP溶液用截留相對(duì)分子質(zhì)量為104的Amicon Ultra-4離心過(guò)濾器(Millipore Billerica，MA)過(guò)濾3次。得到的納米顆粒的形態(tài)和大小利用掃描電鏡進(jìn)行表征。

1.2.4 藥物負(fù)載和藥物釋放研究 為了研究順鉑從Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP中的釋放，將制備的NP溶液100 μL放入截留相對(duì)分子質(zhì)量3.5×103的 Slide-ALyzer MINI滲析管中，之后于37 ℃在pH=5.0，6.0 和7.4 的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)緩沖溶液中滲析，每隔12 h更換PBS。在每個(gè)預(yù)定時(shí)間點(diǎn)從3個(gè)小滲析單元中采集NP溶液用于藥物含量量化以及順鉑濃度量化。

1.2.5 聚合物降解研究 將聚合物NP在pH=5.0，6.0，7.4的PBS中于37℃下溫育，測(cè)定聚合物降解。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集NP樣品，利用三氯甲烷萃取，并在冰冷的乙醚下再次沉淀。利用凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography，GPC)來(lái)確定聚合物相對(duì)分子質(zhì)量的變化。

1.2.6 包封率、載藥量和藥物利用率 采用葡聚糖凝膠過(guò)柱的方法分離被包裹藥物和游離藥物。此法是利用葡聚糖凝膠的分子篩作用，將納米粒大分子與游離藥物小分子分離，計(jì)算公式為:包封率(entrapment rate，ER)=WL/WT ×100%;載藥量(drug loading，DL)=WL/WP ×100%;藥物利用率(recovery，R)=WT/WD×100%(WT:藥物總量，WL:包裹于納米粒中的藥物量，WP:制備納米粒時(shí) PLGA注藥量，WD:藥物用量)，聚合物 NPER、DL、R 分別為:11.24%，1.25% 和99.43%。

1.2.7 細(xì)胞毒性分析 應(yīng)用 MTT檢測(cè)法評(píng)估 Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP對(duì)A2780人卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性，首先將A2780人卵巢癌細(xì)胞接種在96孔板內(nèi)(細(xì)胞密度每孔2×104個(gè))，培養(yǎng)24 h。然后更換新鮮培養(yǎng)液150 μL，并加入Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP溶液50 μL，培養(yǎng)4 h后去除過(guò)量的NP，用新鮮培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次后加入新鮮培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后通過(guò)MTT試劑測(cè)定細(xì)胞存活情況。新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液和PEG-PLA NP作為陰性對(duì)照，各濃度下的游離順鉑作為陽(yáng)性對(duì)照[13]。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析評(píng)估Bi(PEGPLA)-Pt(IV)共軛體NP對(duì)A2780人卵巢癌細(xì)胞增殖的影響，利用t檢驗(yàn)對(duì)連續(xù)數(shù)據(jù)進(jìn)行組間比較，并用Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存率分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件為NCSS 97版，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)共軛體NP形態(tài)表征 從Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)共軛體NP的掃描電鏡圖中(圖1)，可以看出所形成的納米顆粒呈現(xiàn)較均一的膠束形態(tài)，其粒徑為(82.0 ±3.0)nm，粒徑 ＜100 nm，這與相應(yīng)的PEG-PLA聚合物NP所呈現(xiàn)的粒徑相似。

圖1 Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)共軛體NP的掃描電鏡圖(×200)Fig.1 Scanning electron microscope image of Bi(PEGPLA)-Pt(IV)conjugate NP(×200)

2.2 藥物負(fù)載、釋放以及聚合物的降解 利用電感耦合等離子體光發(fā)射譜測(cè)定NP的順鉑負(fù)載率(即負(fù)載到NP中的順鉑占加入順鉑總量的比例)。根據(jù)藥物釋放動(dòng)力學(xué)，分別以順鉑負(fù)載率和時(shí)間為縱橫坐標(biāo)軸作圖，見(jiàn)圖2所示，在聚合物-前體藥物共軛體制備過(guò)程中加入的Pt(IV)前體藥物越多，其順鉑的藥物負(fù)載率就越高。初始Pt(IV)/PEG-PLA反應(yīng)比為2∶1，4∶1和6∶1時(shí)，得到的順鉑藥物負(fù)載率分別為(0.35 ±0.01)%，(0.89 ±0.02)%和(1.05 ±0.03)%(P＜0.01)。當(dāng)Pt(IV)/PEG-PLA的摩爾比高于6∶1時(shí)，藥物負(fù)載率無(wú)顯著升高跡象。

圖2 Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP在各種初始Pt(IV)/PEG-PLA反應(yīng)摩爾比下的順鉑負(fù)載率Fig.2 Cisplatin loading yield of Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NPs at various initial Pt(IV)/PEG-PLA reaction molar ratios

順鉑在3 個(gè)不同的 pH(5.0，6.0 和7.4)時(shí)的釋放動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)見(jiàn)圖3，順鉑在pH=5.0和6.0時(shí)的釋放率顯著高于pH=7.4的釋放率。當(dāng)順鉑負(fù)載率為1.05%時(shí)，pH=5.0和6.0的環(huán)境中 Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP釋放50%的藥物時(shí)分別需要4和6 h，在pH=7.4時(shí)需要22 h。該釋放量的差別在藥物開(kāi)始釋放的最初幾個(gè)小時(shí)最為明顯——在開(kāi)始的前2 h內(nèi)，pH=5.0和6.0時(shí)順鉑釋放率分別為17%和15%，而在pH=7.4時(shí)僅為2%。

圖3 順鉑從Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP的釋放曲線(xiàn)Fig.3 Cisplatin release profile from Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NPs

選定不同的時(shí)間點(diǎn)，分別采集PEG-PLA NP樣品，利用GPC來(lái)測(cè)定聚合物的相對(duì)分子質(zhì)量，見(jiàn)圖4所示，培養(yǎng)50 h 后，在 pH=5.0，6.0 和7.4 時(shí)，聚合物相對(duì)分子質(zhì)量分別降低20%，18%和8%，驗(yàn)證了PLA作為生物可降解聚合物，在中性和酸性環(huán)境中可水解為較小的片段或單體。

圖4 PEG-PLA NP 在 pH 5.0，6.0 和7.4 時(shí)的降解率Fig.4 Hydrolytic degradation rate of PEG-PLA NPs at pH 5.0，6.0，and 7.4

2.3 細(xì)胞毒性分析結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)選取A2780人卵巢癌細(xì)胞作為模型癌細(xì)胞，通過(guò)MTT檢測(cè)法檢測(cè)了 Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP的體外細(xì)胞毒性。培養(yǎng)4 h后Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP的細(xì)胞生存能力降低至65%(P＜0.01)，而PEG-PLA NP對(duì)卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性可忽略不計(jì)，同樣細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)照組也未顯示出明顯的細(xì)胞毒性。在10，50 和 100 μmol·L－1下的游離順鉑的細(xì)胞生存能力分別為99%(P＜0.05)，62%(P＜0.01)和35%(P ＜0.01)。另外在本實(shí)驗(yàn)中包裹在Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP中的鉑化合物只相當(dāng)于7 μmol·L－1游 離 的 順 鉑，然 而 卻 起 到 了 與50 μmol·L－1游離的順鉑的細(xì)胞毒性效果。可見(jiàn)酸響應(yīng)藥物載體Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP顯著提高了藥物的生物利用度。然而筆者并未對(duì)Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP對(duì)正常細(xì)胞的影響進(jìn)行研究，這是有待完善之處。

3 討論

隨著靶向治療的深入，納米藥物載體在腫瘤治療中顯示出廣闊的應(yīng)用前景。PEER等[14]將多柔比星通過(guò)可酸解的腙鍵共價(jià)結(jié)合到聚乙二醇聚合物上，其中連接多柔比星與聚合物的腙鍵響應(yīng)于pH的刺激，從而延長(zhǎng)多柔比星在血液中的循環(huán)時(shí)間，并且由于增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)使得更多的多柔比星在腫瘤處聚集，減少了不良反應(yīng)，在上述研究的基礎(chǔ)上，筆者對(duì)順鉑的納米囊進(jìn)行了研究，以提高順鉑的生物利用度和治療效果。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究合成的Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP的粒徑＜100 nm，符合對(duì)體內(nèi)藥物載體材料的大小要求，能夠有效地逃脫體內(nèi)清除機(jī)制，提高藥物的生物利用度。同時(shí)，該共軛聚合物納米粒徑與未共軛順鉑的PEG-PLA NP所形成的粒徑差別不大，說(shuō)明共軛順鉑之后并沒(méi)有影響聚合物NP的形成。藥物負(fù)載實(shí)驗(yàn)顯示，初始Pt(IV)/PEG-PLA反應(yīng)摩爾比增加到8∶1時(shí)，聚合物鏈與順鉑的結(jié)合已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，所有PEG-PLA聚合物已經(jīng)全部與Pt(IV)發(fā)生共軛，藥物負(fù)載率沒(méi)有顯著提高。藥物的釋放實(shí)驗(yàn)表明，順鉑從Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP中的釋放是pH依賴(lài)型的，這主要是由于順鉑是通過(guò)腙鍵而共軛于聚合物鏈上的，而腙鍵是一種酸響應(yīng)鍵。在pH=5～6時(shí)，腙鍵可在幾分鐘內(nèi)迅速斷裂以釋放出藥物，從而使藥物從NP中擴(kuò)散出來(lái)。在pH=7時(shí)，腙鍵相對(duì)穩(wěn)定，所觀(guān)測(cè)到的順鉑釋放，可能是由于共軛連接順鉑前體藥物的可降解聚合物PLA的降解造成的。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)可得出結(jié)論，在3種pH下培養(yǎng)24 h后聚合物相對(duì)分子質(zhì)量的降低水平幾乎可以忽略不計(jì)，即最初的二十幾個(gè)小時(shí)內(nèi)藥物的迅速釋放是由于腙鍵的斷裂而不是聚合物的降解。細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)顯示Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP能夠明顯地降低A2780人卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞存活率，并且其所共軛順鉑藥物量只相當(dāng)于7 μmol·L－1游離順鉑藥物，卻可以達(dá)到與50 μmol·L－1游離順鉑藥物的細(xì)胞毒性的效果，證實(shí)了Bi(PEG-PLA)-Pt(IV)NP對(duì)A2780人卵巢癌細(xì)胞具有較高的細(xì)胞毒性，且顯著提高了順鉑的生物利用度。其機(jī)制主要為:采用納米模式能將化療藥物在準(zhǔn)確的時(shí)間遞送至病變部位，并保證藥物具有足夠長(zhǎng)的作用時(shí)間。更為重要的是腫瘤細(xì)胞膜上P糖蛋白的過(guò)表達(dá)可以阻止藥物進(jìn)入細(xì)胞，同時(shí)還能將部分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出，這是腫瘤耐藥的重要機(jī)制[15]，而采用納米封裝技術(shù)的藥物能夠避開(kāi)腫瘤細(xì)胞膜上高表達(dá)的跨膜蛋白(P糖蛋白)的識(shí)別，不僅可將藥物分子靶向轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的細(xì)胞或器官，還可遞送細(xì)胞難以攝取的生物大分子藥物(如核酸、蛋白質(zhì))至細(xì)胞內(nèi)的活性部位，提高了治療的效率[16]。

綜上所述，本研究合成的新型酸響應(yīng)Bi(PEGPLA)-Pt(IV)聚合物-順鉑前體藥物共軛NP可以作為一種新的順鉑藥物遞送載體，具有良好的酸響應(yīng)釋放動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)，能夠增強(qiáng)對(duì)癌癥細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。同時(shí)增強(qiáng)藥物靶向性，降低對(duì)其他組織細(xì)胞的毒副作用。與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的繁瑣的屏蔽-去屏蔽保護(hù)方法相比，更具有可行性。這種新型酸響應(yīng)Bi(PEGPLA)-Pt(IV)聚合物-順鉑前體藥物共軛NP有望成為更優(yōu)良的抗腫瘤制劑，為新型功能化藥物運(yùn)載系統(tǒng)的研究奠定基礎(chǔ)。

[1]GALANSKI M，ARION V B，JAKUPEC M A.Recent developments in the field of tumor-inhibiting metal complexes[J].Curr Pharm Des，2003，9(10):2078 －2089.

[2]PASINI A，ZUNINO F.New cisplatin analogues-on the way to better antitumor agents[J].Angew Chem Int Ed Engl，1987，26(5):615 －624.

[3]WONG E，GIANDOMENICO C M.Current status of platinum-based antitumor drugs[J].Chem Rev，1999，9(10):2451－2466.

[4]ANDREWS P A，WUNG W E，HOWELL S B.A highperformanceliquid chromatographic assay with improved selectivity for cisplatin and active platinum(II)complexes in plasma of rat[J].Anal Biochem，1984，143(1):46 －56.

[5]BORCH R F，PLEASANTS M E.Inhibition of cis-platinum nephrotoxicity by diethyl dithiocarbamate rescue in a rat model[J].Proc Natl Acad Sci USA，1979，76(24):6611 －6614.

[6]DOLMAN R C，DEACON G B，HAMBLEY T W.Studies of the binding of a series of platinum(IV)complexes to plasma proteins[J].J Inorg Biochem，2002，88(2):260 －267.

[7]ANG W H，KHALAILA I，ALLARDYCE C S.Rational design of platinum(IV)compounds to overcome glutathione-stransferase mediated drug resistance[J].J Am Chem Soc，2005，127(10):1382 －1383.

[8]DHAR S，GU F X，F(xiàn)AROKHZAD O C.Targeted delivery of cisplatin to prostate cancer cells by aptamer functionalized Pt(IV)prodrug-PLGA-PEG nanoparticles[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(24):17356 －17361.

[9]OHYA Y，OUE H，NAGATOMI K.Design of macromolecular prodrugofcisplatin usingdextran with branched galactose units as targeting moieties to hepatoma cells[J].Biomacromolecules，2001，2(7):927 －933.

[10]ANG W H，PILET S，SCOPELLITI R.Synthesis and characterization ofplatinum(IV)anticancerdrugswith functionalized aromatic carboxylate ligands:influence of the ligands on drug efflucacies and uptake[J].J Med Chem，2005，48(24):8060 －8069.

[11]NISHIYAMA N，OKAZAKI S，CABRAL H.Novel cisplatinincorporated polymeric micelles can eradicate solid tumors in mice[J].Cancer Res，2003，63(24):8977 － 8983.

[12]NISHIYAMA N，YOKOYAMA M，AOYAGI T.Preparation and characterization of self-assembled polymer-metal complex micelle from cis-dichlorodiammineplatinum(II)and poly(ethylene glycol)-poly(α，β-aspartic acid)block copolymer in an aqueous medium[J].Langmuir，1999，15(2):377－383.

[13]KURODA R，ISMAIL I M，SADLER P J.X-ray and NMR studies of trans-dihydroxo-platinum (IV)antitumor complexes[J].J Inorg Biochem，2003，22(1):103 －117.

[14]PEER D，KARP J M，HONG S，et al.Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy[J].Nat Nanotechnol，2007，2(5):751 －760

[15]GOTTESMAN M M.Mechanisms of cancer drug resistance[J].Ann Rev Med，2002，53(4):615 －627.

[16]XU P，VAN KIRK E A，MURDOCH W J，et al.Anticancer efficacies of cisplatin-releasing pH-responsive nanoparticles[J].Biomacromolecules，2006，7(7):829 －835.