單克隆抗體制備的篩選過程及意義

摘要：隨著單克隆抗體技術(shù)應(yīng)用的愈加廣泛，其生產(chǎn)技術(shù)也日臻完善。本文就單克隆抗體制備的篩選過程及意義進(jìn)行了闡述。

關(guān)鍵詞：單克隆；抗體；篩選

中圖分類號：R392 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1674-0432（2014）-17-20-1

1975年英國劍橋皇家醫(yī)學(xué)委員會分子生物學(xué)實驗室的Kohler和Milstein成功的用細(xì)胞雜交方法把能夠產(chǎn)生針對特定抗原的抗體分泌細(xì)胞分離出來，在體外長期傳代并分泌特異性抗體，這些細(xì)胞經(jīng)過克隆化，可以形成單克隆細(xì)胞，能產(chǎn)生針對某一特定抗原決定簇的完全相同的純凈抗體，即單克隆抗體（monoclonal antibody，McAb），簡稱單抗。

在單克隆抗體制備過程中，一般需要經(jīng)歷三次篩選過程。

1 HAT選擇雜交瘤

細(xì)胞融合的選擇培養(yǎng)液中有三種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤（hypoxanthine，H）、甲氨蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T），取三者的字頭成為HAT培養(yǎng)液。細(xì)胞DNA合成一般有兩條途徑：主途徑是由氨基酸和糖合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA，葉酸作為重要的輔酶參與這一合成過程；另一替代途徑是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸存在的情況下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成DNA。甲氨蝶呤是葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細(xì)胞正常合成DNA，而融合所用的瘤細(xì)胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)液選出的HGPRT-細(xì)胞株，所以不能在HAT培養(yǎng)液中存活。因為融合細(xì)胞具有親代雙方的遺傳性能，所以可在HAT培養(yǎng)液中長期存活與繁殖，從而達(dá)到細(xì)胞分離和純化的目的。

在單克隆抗體制備過程中，由于細(xì)胞融合是一個隨機(jī)的物理過程，小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞混合細(xì)胞懸液中，經(jīng)融合后細(xì)胞可能有多種形式，不一定就是需要的雜交瘤細(xì)胞，如融合的脾細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞、融合的脾細(xì)胞和脾細(xì)胞、融合的瘤細(xì)胞和瘤細(xì)胞、未融合的脾細(xì)胞、未融合的瘤細(xì)胞以及細(xì)胞的多聚體形式等。正常的脾細(xì)胞在培養(yǎng)液中存活僅5～7天，無需特別篩選，細(xì)胞的多聚體形式也容易死去，而未融合的瘤細(xì)胞則需要進(jìn)行進(jìn)一步特別的篩選取出。

2 抗體的檢測與篩選

篩選雜交瘤細(xì)胞通過選擇培養(yǎng)而獲得的雜交細(xì)胞系中，僅少數(shù)能分泌針對免疫原的特異性抗體，因此需要檢測特異性抗體，并篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，需選擇不同的篩選方法。常見的為酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），根據(jù)反應(yīng)結(jié)果即可挑選出所需的陽性雜交瘤細(xì)胞系。

3 有限稀釋法篩選

在單克隆抗體的生產(chǎn)過程中，由于效應(yīng)B淋巴細(xì)胞的特異性是不同的，經(jīng)HAT培養(yǎng)液篩選出的雜交細(xì)胞產(chǎn)生的抗體存在差異，必須對雜交瘤細(xì)胞群進(jìn)行再次篩選，選出能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。因此采用有限稀釋克隆細(xì)胞的方法，將雜交瘤細(xì)胞多倍稀釋，接種在多孔的細(xì)胞培養(yǎng)板上，使每孔細(xì)胞不超過一個，通過培養(yǎng)讓其增殖，然后檢測每個孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附法），上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細(xì)胞還不能保證是單個細(xì)胞的，繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋，一般重復(fù)3～4次，直至確定每個孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞為止。

本次篩選也是鑒定的過程。一般雜交瘤細(xì)胞需經(jīng)過2～3次反復(fù)克隆后，才能達(dá)到100%細(xì)胞陽性率，這個方法法也同樣適用于一般細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞純化、突變細(xì)胞株的選擇、識別和分離。

4 意義

通過HAT培養(yǎng)液的篩選作用，正常的脾細(xì)胞在培養(yǎng)液中存活僅5～7天，細(xì)胞的多聚體形式也容易死去，而未融合的瘤細(xì)胞則需要進(jìn)行特別的篩選取出，從而達(dá)到篩選出融合的雜交瘤細(xì)胞的目的。但此時融合的雜交瘤細(xì)胞僅有少數(shù)能分泌針對特定免疫原的特異性抗體，因此需進(jìn)行第二次篩選，即抗體的檢測與篩選。但這次篩選出的抗體能力存在差異，仍需進(jìn)一步篩選，即第三次篩選，選出活力好、抗性強(qiáng)的細(xì)胞。

經(jīng)過三次篩選過程，最終可選出產(chǎn)生特定抗體的穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞，并保證細(xì)胞板的每個孔中增殖的細(xì)胞均為單克隆細(xì)胞，從而分泌出單一高效的單克隆抗體。

參考文獻(xiàn)

[1] Kohler G，Nature C Continuous cultures of fused cells

secreting antibody of predefined specificiyt[J]. Nature，1975.256（4）：495-497.

[2]許保疆等.單克隆抗體在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用[J]. 中國畜牧獸醫(yī)， 2010.37，（7）：86-88.

[3]周東坡，生物制品學(xué)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社， 2007.

作者簡介：趙慧娟，碩士學(xué)歷，長春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥學(xué)系，講師，研究方向：生物工程。