耳緣靜脈放血對偏頭痛家兔模型的鎮痛效應及中腦導水管周圍灰質c-fos表達的影響

楊佃會，馬祖彬，韓 晶，陳新勇

(1.山東中醫藥大學，濟南250355;2.山東中醫藥大學附屬醫院，濟南250011;3.單秋華全國名老中醫藥專家傳承工作室，濟南250011)

耳緣靜脈放血對偏頭痛家兔模型的鎮痛效應及中腦導水管周圍灰質c-fos表達的影響

楊佃會1，2，3，馬祖彬2，3，韓 晶2，3，陳新勇2，3

(1.山東中醫藥大學，濟南250355;2.山東中醫藥大學附屬醫院，濟南250011;3.單秋華全國名老中醫藥專家傳承工作室，濟南250011)

目的 觀察耳緣靜脈放血對偏頭痛家兔模型的鎮痛效應及對中腦導水管周圍灰質(PAG)c-fos的表達，從而揭示耳緣靜脈放血的鎮痛作用機制。方法 30只新西蘭家兔按隨機數字表分為耳緣靜脈放血組、模型組和空白組。按5 mg/kg標準連續3 d頸后皮下注射硝酸甘油復制偏頭痛家兔模型，在第3天造模60 min后耳緣靜脈放血，分別在造模前、造模30 min和放血后即刻進行痛閾測定。免疫組化法觀察偏頭痛家兔模型PAG區c-fos表達。結果 痛閾改變:造模30 min耳緣靜脈放血組和模型組的痛閾明顯降低，與造模前比較有統計學意義(P＜0.01)，與空白組比較均有統計學意義(P＜0.01);耳緣靜脈放血組放血后即刻痛閾明顯升高，與造模30 min比較有統計學意義(P＜0.01)，與模型組比較有統計學意義(P＜0.05);耳緣靜脈放血組家兔模型PAG區c-fos陽性細胞數明顯降低，與模型組比較有統計學意義(P＜0.01)。結論 耳緣靜脈放血有明顯的鎮痛作用，通過抑制偏頭痛家兔模型PAG區c-fos基因表達發揮了鎮痛效應。

耳緣靜脈放血;偏頭痛;家兔模型;c-fos;痛閾測定

筆者既往臨床觀察耳穴綜合療法治療偏頭痛療效顯著［1］，并對外周神經遞質的作用機制也進行了初步探討［2-4］。耳背靜脈放血為關鍵技術，能夠明顯降低中腦導水管周圍灰質PAG區G蛋白含量［5］，而對PAG區c-fos蛋白的影響尚不清楚，探討對PAG區c-fos蛋白的表達進一步揭示耳緣靜脈放血的中樞鎮痛機制。

1 材料與方法

1.1 材料 1)實驗動物:健康純種新西蘭家兔30只，體質量1.5～2.5 kg，雌雄各半，由濟南西嶺角養殖繁育中心提供，生產許可證號:SCXK(魯)20090013。將30只純種新西蘭家兔按隨機數字表法分為耳緣靜脈放血組、模型組和空白組，每組10只，雌雄各半。2)主要試劑和儀器:硝酸甘油注射液(5 mg/1 mL，北京益民藥業有限公司，批號20111202)，c-fosAntibody(S-045-50，0.05 mg，購自濟南美斯泰商貿發展有限公司，Novus生產)，免疫組化染色試劑盒(PV-9003，北京中杉金橋生物技術有限公司)，DAB試劑盒(ZLI-9018，北京中杉金橋生物技術有限公司)。組織脫水機(ASP300S，LEICA)，石蠟包埋機(EG1150H，LEICA)，生物組織攤烤片機(YT-7FB，亞光醫用電子技術有限公司)，顯微鏡(BX51，OLYMPUS)，丹吉爾數字醫學圖像分析系統(DEIAS-2000P/C/E/U，濟南丹吉爾電子有限公司)，WQ-9E測痛儀(北京海淀區電子儀器廠生產)。

1.2 模型制備 參照經典硝酸甘油造模法，按5 mg/kg標準頸后皮下注射硝酸甘油造模。造模1次/d，分別在第3天造模前、造模30、60 min后進行痛閾測定。痛閾測定法:采用鉀離子透入法。安靜環境中，將家兔固定在固定器中，先用脫毛劑脫去兩側耳朵毛，在家兔一側耳表面安裝含有飽和氯化鉀溶液的電極，無關電極接在另一側耳，兩個電極與QW-9E測痛儀相連，用電流強度線型遞增的直流電將K+導入皮膚做痛刺激。選用階梯輸出，電流強度0～10 mA，階寬1 s，階高0.1 mA。以家兔頭部開始出現掙扎反應作為疼痛指標，經引起家兔掙扎反應的最小電流強度作為痛閾，共測3次，每次間隔5 min，取其平均值作為痛閾。

1.3 治療方法 耳緣靜脈放血組第3天造模30 min后耳緣靜脈放血1次。用75%的乙醇棉球在耳緣靜脈處進行局部消毒，實驗者以一手固定住家兔的耳朵，另一手持一次性注射針頭于耳緣靜脈遠心端快速點刺使之出血，雙側耳緣靜脈可出血約2～3 mL。放血后30 min進行痛閾測定。

1.4 標本處理 用戊巴比妥鈉按30 mg/kg標準耳緣靜脈注射麻醉，麻醉成功后，仰臥固定，開胸，左心室插管，剪開右心耳，先迅速灌注生理鹽水，至家兔肝臟及腸系膜變蒼白后，再灌注4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液500 mL，以固定標本。灌注結束后，打開顱腔將全腦取出，置于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中后固定，并標號。參照Sawyer氏圖譜定位，切取中腦導水管周圍灰質區脫水、包蠟。對PAG區作連續冠狀切片，每張片厚3 μm，腦切片每隔5張留取一張，共選取5張切片。

1.5 免疫組織化學染色 3%H2O2去離子水孵育10 min;蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min×3次;滴加1∶150稀釋的一抗，37℃孵育1 h;PBS沖洗，3 min×3次;滴加試劑1，37℃孵育20 min;PBS沖洗，3 min×3次;滴加試劑2，37℃孵育20 min;PBS沖洗，3 min×3次。將玻片甩干后，滴加DAB顯色劑，顯色2 min。自來水充分沖洗。復染，脫水，透明，封片。陰性對照組以PBS代替一抗。

1.6 圖像分析 c-fos免疫組化染色，鏡下可見背景為米白色，c-fos免疫反應陽性神經元呈黃褐色，以核染為主。光鏡下觀察每張切片的中央、左上、左下、右上、右下5個高倍視野的陽性細胞數之和。

1.7 統計學分析 所有數據輸入計算機用SPSS 17.0 for windows軟件進行統計分析。計量資料用均數±標準差(±s)表示，采用方差分析，組間比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 3組偏頭痛家兔模型痛閾改變情況比較 見表1。

表1 3組偏頭痛家兔模型痛閾改變情況比較(±s，n=10)mA

表1 3組偏頭痛家兔模型痛閾改變情況比較(±s，n=10)mA

注:與造模前比較，##P＜0.01;與造模 30 min比較，△△P＜0.01;與空白組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;與模型組比較，★P＜0.05

組 別 造模前 造模后30 min 造模后60 min空白組 7.82±1.35 7.42±1.76 7.47±1.39模型組 8.11±0.75 4.29±1.09##▲▲3.66±1.12▲▲耳緣靜脈放血組 7.91±1.49 4.06±1.05##▲▲5.92±1.65△△▲★

2.2 3組偏頭痛家兔模型PAG區c-fos陽性細胞數比較 見表2。

表2 3組偏頭痛家兔模型PAG區c-fos陽性細胞數比較(±s，n=10)

表2 3組偏頭痛家兔模型PAG區c-fos陽性細胞數比較(±s，n=10)

注:與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組比較，△△P＜0.01

組 別 c-fos 陽性細胞數空白組 61.70±13.99模型組 301.40±33.43##耳緣靜脈放血組 155.20±27.66#△△

3 討論

耳穴治療偏頭痛歷史悠久，早在《靈樞·厥病》中有耳背放血治療頭痛的記載:“頭痛甚，耳前后動脈涌有熱，瀉出其血?！薄鹅`樞·口問》曰:“耳者，宗脈之所聚也?！闭f明經絡與耳有十分密切的聯系。偏頭痛發病日久，瘀血阻絡是一個重要證型［6］，活血化瘀為內治大法［7-8］，而采用耳背靜脈放血法切中病機。同時現代醫學也證實了耳廓有來自諸如耳大神經、枕小神經、耳顳神經、面神經、舌咽神經、迷走神經的分支及交感神經等。刺激耳廓某些特定部位，可以促進腦組織乳酸堆積的清除、抑制自由基反應，從而調節腦內興奮性氨基酸遞質代謝，減輕神經元細胞損傷的作用［9］，通過神經體液途徑，調節機體內分泌系統、免疫系統［10］，起到通調氣血，祛邪止痛作用［11］。

近年來發現c-fos基因參與重要腦功能活動的信號轉導和調控過程。硝酸甘油模型引起三叉神經纖維的超敏性，引發頭痛，可引起c-fos在三叉神經脊束背核尾側亞核(TNC)內相似區域的快速表達［12-16］。有研究［17］表明鼻療法噴霧劑能治療偏頭痛的作用機制是控制中腦導水管周圍灰質c-fos蛋白的表達。本研究結果耳緣靜脈放血能明顯升高偏頭痛家兔模型的痛閾(P＜0.01)，與模型組比較有統計學意義(P＜0.05)，說明耳緣靜脈放血能明顯升高偏頭痛家兔模型痛閾，起到明顯的鎮痛效應，其作用機制是通過抑制PAG區c-fos基因的異常表達來參與鎮痛效應。

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C-fos expression in PAG area of ear-edge vein bloodletting on rabbit models of migraine

YANG Dianhui1，2，3，MA Zubin2，3，HAN Jing2，3，CHEN Xinyong2，3
(1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China;2.Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250011，China;3.Famous Traditional Chinese Medical Doctor Shan Qiuhua's Inheritance Studio，Jinan 250011，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the analgesic effect of ear-edge vein bloodletting on rabbit and the influence of c-fos expression in the periaqueductal gray(PAG)area.Consequently，reveal the analgesic mechanism of marginal vein bloodletting ears.Methods30 New Zealand rabbits were randomly divided into 3 groups，ear-edge vein bloodletting group，model group and blank group.By subcutaneous injection nitroglycerin in the rabbits'neck according to the standard of 5 mg/kg for 3 day，the migraine models were successfully copied.The ear-edge vein blood were ensanguined after 60 minutes of molding，pain threshold was determined in front of the building，building immediately after 30 min and bleed.Then we observed the expression of c-fos in PAG of rabbits by immunohistochemical method after the end of the course.ResultsThe change of pain threshold:the pain threshold of ear-edge vein bloodletting group and model group were significantly reduced，compared with before building has a very significant difference(P ＜0.01)，and compared with blank group has a very significant difference(P ＜0.01);the immediate pain threshold of ear-edge vein bloodletting group was increased significantly，compared with after 30 minutes of molding has a very significant difference(P ＜0.01)，and compared with model group has a very significant difference(P ＜0.01);positive cells in the PAG area c-fos of ear-edge vein bloodletting group were significantly decreased，compared with model group(P ＜0.01).ConclusionThe therapy of ear-edge vein bloodletting has analgesic effect，which can decrease the expression of c-fos gene in PAG of rabbit models of migraine.

Key words:ear-edge vein bloodletting;migraine;rabbit model;c-fos;pain threshold determination

R285.5

A

2095－6258(2014)04－0576－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.04.005

山東省自然科學基金資助項目“耳緣靜脈放血對偏頭痛家兔模型鎮痛調控機制的研究”(ZR2009CM058)。

楊佃會(1966－)，男，醫學博士，教授，博士研究生導師。研究方向:耳穴綜合療法治療偏頭痛。

(

2014－04－02)