石參提取物誘導MKN-45細胞凋亡的初步研究

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(西北農林科技大學食品科學與工程學院,陜西楊凌 712100)

石參提取物誘導MKN-45細胞凋亡的初步研究

劉鴻儒,王玉堂,劉學波*

(西北農林科技大學食品科學與工程學院,陜西楊凌 712100)

通過石參提取物作用于人胃癌MKN-45細胞,檢測其對細胞活性的影響并探討其作用機制。利用MTT法檢測石參提取物對細胞活性的影響；采用AO/EB雙熒光染色檢測石參提取物對細胞形態的影響；使用JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位變化；利用Western blot檢測石參提取物對細胞凋亡內源性通路的信號蛋白表達。結果表明濃度為20、30mg/mL的石參提取物能夠抑制MKN-45細胞的活性,使細胞形態發生改變；10、20、30mg/mL的石參提取物可引起細胞線粒體膜電位下降,并引起Bcl-2的表達量下降,Bax、細胞色素c和caspase-3的表達量增加,PARP被剪切。提示石參提取物可通過線粒體途徑誘導MKN-45細胞凋亡。

石參,MKN-45細胞,凋亡,線粒體途徑

胃癌的發病率和死亡率居全世界惡性腫瘤的前列[1](,在我國同樣居高不下,且死亡率仍有上升趨勢[2-3],嚴重威脅著人類的生命健康。現今胃癌的治療仍以手術為主,但術后的復發率較高,而在輔助化療中常見接觸藥物之后產生的耐藥性[4-5],也是術后存活率不高的原因之一[6]。一些食品中的天然活性成分毒副作用小,具有預防和治療的雙重功效,已成為近年來的研究熱點之一。

癌癥發生的本質是癌細胞增殖與凋亡的失衡。因此抑制癌細胞增殖與誘導癌細胞凋亡已成為防治惡性腫瘤的主要手段之一[7]。各種天然食品的提取物中含有大量的生物活性物質,對惡性腫瘤具有一定程度的抑制作用[8-10]。這些提取物可通過腫瘤細胞內不同的通路誘導細胞調亡,具有防癌和抑制腫瘤的潛質。

石參又名石蒜苔、崖參,是百合科獨尾草屬(EremuruschinensisFedtsch.)[11]的根。石參作為一種山野菜,味道甘甜,營養豐富,曾被列為貢品,有“崖參上皇宴”的美談[12]。石參中除了富含蛋白質、脂類和礦質元素等之外,還含有功能性多糖、酚類和黃酮類化合物、甾體以及蒽醌類化合物等多種活性成分[13-15]。已有的研究表明石參提取物具有很強的抗氧化活性,抑制自由基損傷生物大分子,且可以誘導肝癌細胞的凋亡[16-17]。在新疆少數民族地區有用獨尾草根焙干磨粉沖服用于治療消化道頑疾的習慣[18],但其作用機理還尚不明確。本研究擬通過利用石參的提取物誘導人胃癌細胞MKN-45凋亡,探討其對胃癌細胞的作用及相關作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

石參 購于陜西漢中略陽；人胃癌MKN-45細胞 中科院上海細胞庫；DMEM培養基、胎牛血清 美國Hyclone公司；抗生素(青霉素/鏈霉素)、胰蛋白酶、吖啶橙/溴化乙錠(acridine orange/ethidium bromide,AO/EB) 江蘇碧云天公司；噻唑蘭(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT) 美國Amresco公司；JC-1熒光探針 美國Thermo公司；Anti-Bax Antibody、Anti-Bcl-2 Antibody、Anti-cytochrome c Antibody、Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody、Anti-α-tubulin Antibody、Anti-PARP Antibody、標記二抗 美國Santa Cruz公司；PVDF膜、ECL發光液 美國Millipore公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS) 實驗室配制。

680 酶標儀、165-8001垂直電泳槽、ChemiDoc XRS凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；QYC110臺式恒溫振蕩器 上海福瑪公司；微量移液槍、5417R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；BCN-1360B生物潔凈工作臺 北京東聯電子技術開發公司；3110型細胞培養箱 美國Thermo Scientific 公司；LX71倒置熒光顯微鏡 日本奧林巴斯株氏會社。

1.2實驗方法

1.2.1 石參提取物制備 將石參烘干粉碎,用60%(V/V)乙醇超聲波(超聲功率500W)提取2h,使用相同條件重復提取殘渣,合并提取液旋轉蒸發,冷凍干燥后得到石參提取物[17]。

1.2.2 人胃癌MKN-45細胞的培養 將人胃癌MKN-45細胞置于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養基中,在37℃、5% CO2的培養箱中培養,長滿80%～90%時傳代,選取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.3 MTT法測定石參提取物對MKN-45細胞的毒性作用 將MKN-45細胞接種到96孔板中,每孔100μL細胞液,種板密度為3×104個/孔,于37℃、5% CO2培養箱中培養。24h后棄去培養基并用PBS清洗,然后加入含有不同濃度石參提取物(0、10、20、30mg/mL)的無血清培養基(0mg/mL為對照組),每孔100μL,每組10復孔(其中4復孔為空白,不加入MTT),繼續培養。24h后棄去培養基并用PBS清洗,每組6孔加入100μL含MTT(0.5mg/mL)的無血清培養基,培養4h后棄去培養基,每孔加入100μL DMSO,充分溶解。用酶標儀測量各孔在490nm的光密度(OD值)。按公式(1)計算細胞相對存活率:細胞相對存活率(%)=(處理組OD值-處理組空白OD值)/(對照組OD值-對照組空白OD值)×100(1)

1.2.4 石參提取物對MKN-45細胞形態學的影響 AO能夠穿過細胞膜完整的細胞,嵌入核DNA發出明亮綠色熒光。EB僅能穿過細胞膜受損的細胞,嵌入核DNA發出橘紅色熒光,凋亡的細胞橘紅色熒光增強增多。將MKN-45細胞接種于6孔板(密度為1.5×105/孔),37℃、5% CO2培養箱中培養24h后,經不同濃度石參提取物(0、10、20、30mg/mL)處理24h,棄去原培養基后用PBS清洗,每孔加入60μL AO/EB(AO∶EB=1∶1),置于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 線粒體膜電位測定 前期培養過程與1.2.3相同,在用含不同濃度石參提取物(0、10、20、30mg/mL)的無血清培養基培養細胞24h后,棄去原培養基并用PBS清洗,加入100μL JC-1工作液,37℃繼續培養1.5h,棄去JC-1并用PBS清洗2遍,換入新PBS,在激發光波長485nm,發射光波長585、538nm下,測定熒光強度。若OD585/OD538比值與對照組相比降低,表明線粒體膜電位下降。

1.2.6 Western blot蛋白檢測 將對數生長期的MKN-45細胞接種于60mm×10mm培養皿中,于37℃、5% CO2培養箱中培養。當細胞長滿80%時,棄去培養基,每皿加入含不同濃度石參提取物(0、10、20、30mg/mL)的無血清培養基處理。24h后終止培養,棄去原培養基,用PBS清洗3遍后吸干溶液,向各培養皿中分別加入細胞裂解液(含蛋白酶抑制劑和氟化鈉)100μL,10min后刮取細胞碎片,冷凍離心(4℃,15000r/min)10min,取上清液測蛋白濃度(BCA法),對樣品進行不同程度稀釋,使各樣品濃度一致。向各樣品中加入蛋白電泳上樣緩沖液,95℃加熱5min,冷卻混勻。

取15μL各蛋白樣品(3mg/mL)經10%的SDS-PAGE進行分離,電泳條件:S1,80V,10min；S2,120v,2h。然后將蛋白轉印至PVDF膜上,用5%脫脂乳室溫封閉2h,用1×TBST緩沖液清洗。將膜放入一抗(1∶1000,V/V),4℃孵育過夜。以1×TBST緩沖液清洗,加二抗(1∶1000,V/V)孵育2.5h后,1×TBST緩沖液清洗。最后使用ECL發光液熒光顯色,ChemiDox凝膠成像系統成像。

1.3數據分析

實驗數據用Microsoft Excel 2003處理,SPSS16.0軟件進行統計學分析,顯著水平p設定為0.05(p<0.05)。

2 結果與分析

2.1石參提取物抑制MKN-45細胞活性作用的測定

圖1顯示,石參提取物處理24h后,低濃度(10mg/mL)對MKN-45細胞活力無影響,而較高濃度石參提取物(20、30mg/mL)可顯著降低細胞活力,細胞存活率分別為49.12%和52.81%,30mg/mL處理組的細胞活力稍高,但經統計學分析后表明二者無顯著性差異。

2.2石參提取物誘導MKN-45細胞發生形態學變化

如圖2所示,對照組細胞呈綠色梭狀,10mg/mL石參提取物處理組與對照組相比細胞固縮變圓,20、30mg/mL石參提取物處理組與對照組相比,細胞變圓膨大,呈橘色、紅色細胞數量增加,細胞發生凋亡甚至死亡。

圖1 石參提取物抑制MKN-45細胞活性的作用Fig.1 Inhibition effect of ECFE on MKN-45 cells viability注:采用Duncan多重比較,不同的上標字母a、b、c表示 差異顯著(p<0.05),圖3、圖4同。

圖2 石參提取物對MKN-45細胞形態學的影響(×200)Fig.2 The effect of ECFE on morphology alteration of MKN-45 cells(×200)注:A. 對照,B. 10mg/mL,C. 20mg/mL,D. 30mg/mL。

2.3石參提取物降低MKN-45細胞線粒體膜電勢(ΔΨ)

線粒體膜電位的降低是細胞凋亡早期的不可逆事件[19]。由圖3可知,10mg/mL的石參提取物處理組與對照組相比,即可顯著地降低MKN-45細胞的線粒體膜電位,而20、30mg/mL的石參提取物更為明顯地引發細胞線粒體膜電位的降低。對照組與處理組的OD585/OD538比值分別為7.90、1.70、0.40、0.40。

圖3 石參提取物對MKN-45細胞線粒體膜電勢的影響Fig.3 The effect of ECFE on mitochondrial membrane potential of MKN-45 cells

2.4石參提取物通過線粒體途徑誘導MKN-45細胞凋亡

與對照組相比,10、20、30mg/mL石參提取物可抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,促進促凋亡蛋白Bax的表達(圖4A),進而引起線粒體膜的通透性的改變,細胞色素c釋放到胞漿中,caspase-3蛋白被激活,將PARP剪切為不同分子量的片段(圖4B)。其中Bcl-2/Bax的比值依次為4.83、1.04、0.48、0.21(圖4C)。

圖4 石參提取物通過內源性通路誘導MKN-45細胞凋亡Fig.4 MKN-45 cells apoptosis via endogenous pathway induced by ECFE

3 討論

采用天然來源的抗癌成分誘導癌細胞凋亡已成為防治癌癥的重要措施之一。已證明在膳食中充足的新鮮果蔬的攝入與胃癌的發病率呈顯著的負相關性[20],其中發揮作用的主要有多糖類、黃酮類化合物、醌類物質和生物堿等,在本實驗中,石參提取物富含多糖、酚類和黃酮類等功能性物質。另外,前期研究揭示,石參提取物具有抗氧化活性,可清除自由基,保護生物大分子[17]。因此,推測石參具有開發為抗氧化及預防腫瘤的功能食品的潛力。

線粒體參與了細胞包括凋亡在內的多種死亡模式[21],是細胞凋亡的調控中心[22-23]。Bcl-2家族在細胞凋亡中起“主開關”的作用,而Bcl-2家族主要的作用位點就在線粒體膜上[24]。本研究中發現石參提取物可以通過抑制Bcl-2和促進Bax的表達,使得線粒體膜的通透性和完整性受到破壞,導致線粒體膜電位急劇下降,促凋亡因子細胞色素c被釋放到細胞質中形成凋亡體,將caspase-3蛋白激活,剪切PARP,細胞凋亡的線粒體通路級聯反應被激活,導致了細胞凋亡。

綜合以上實驗結果,石參提取物能夠顯著抑制人胃癌細胞MKN-45的活性,并通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。該研究為石參防治某些與消化道有關的疾病及功能性食品的開發提供了實驗基礎,為石參這種天然山野菜的保護與開發利用提供了一定的理論依據。然而,關于石參中具體為哪一種功能成分在發揮主要作用,以及是否通過其他細胞通路發揮作用尚不明確,還有待于進一步的研究。

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Preliminary study on apoptosis of MKN-45 cells induced by extracts fromEremuruschinensisFedtsch. roots

LIUHong-ru,WANGYu-tang,LIUXue-bo*

(College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yanglingi 712100,China)

The impact of extracts fromEremuruschinensisFedtsch. roots(ECFE)on MKN-45 cells and mechanisms were discussed. Cell viability was determined by the MTT assay. Morphologic changes was evaluated by AO/EB. Mitochondrial membrane potential of cells was detected via JC-1. Western blot was used to analyse signal proteins in the intrinsic pathway of apoptosis. ECFE reduced the MKN-45 cells viability at higher concentrations(20,30mg/mL),and the alteration of cells was changed. Meanwhile,mitochondrial membrane potential of cells was declined when cells were treated with 10～30mg/mL ECFE. As such,the expression of Bcl-2 was reduced while Bax,cytochrome c and caspase-3 were all increased. PARP was cut. ECFE inhibit viability of MKN-45 cells,and induce apoptosis through mitochondrial pathway.

EremuruschinensisFedtsch.;MKN-45 cells;apoptosis;mitochondrial pathway

2014-01-09 *通訊聯系人

劉鴻儒(1989-),女,在讀碩士,研究方向:營養與功能食品因子。

中央高校基本科研業務費專項資金(2452013QN060)。

TS201.4

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001