適合米酒釀造酵母的分離鑒定及葡萄糖發酵特性研究

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(廣西科技大學 生物與化學工程學院,廣西柳州 545006)

適合米酒釀造酵母的分離鑒定及葡萄糖發酵特性研究

伍保龍,伍時華*,和晶晶,應玲云,易弋,黃翠姬

(廣西科技大學 生物與化學工程學院,廣西柳州 545006)

采用稀釋涂布法,從本地優質米酒酒曲中分離得到27株酵母菌,經初篩和復篩,得到一株產酒精能力強的酵母菌5-1Y。通過菌落、菌體形態觀察、生理生化實驗和26S rDNA序列分析,鑒定出5-1Y為釀酒酵母。將處于對數生長期的菌種接入含不同葡萄糖濃度(50～320g/L)的YEPD培養基,測定發酵液中葡萄糖濃度和菌體死活率變化,研究5-1Y在不同葡萄糖濃度下的發酵特性。實驗結果表明:較高的初始葡萄糖濃度會明顯影響該酵母的發酵產酒精能力,5-1Y的最適宜高葡萄糖發酵濃度為230g/L。

酒曲,分離鑒定,發酵特性

我國傳統米酒酒曲中有多種微生物,為酒體風味物質的形成提供了保障[1]。酒曲在米酒生產中起著糖化、發酵和生香的作用,酒曲中的酵母菌是最重要的發酵菌種,主要分為產酒精的酒精酵母和產芳香物質的產酯酵母,其中酒精酵母是酒曲中主要的產酒功能菌,產酯酵母可產多種醇、醛、酯等芳香物質[2]。酒精酵母的特性對酒的質量和發酵效率有較大影響。

經過大自然長期的選擇作用,傳統米酒酒曲中的酒化菌逐漸適應了當地的土壤,釀造出的米酒具有獨特的地方特色。廣西柳州、南寧和桂林等地有很多作坊式米酒酒廠,生產出的米酒美味可口,深受人們喜愛。因此,研究分析這些區域優良酒曲的生物多樣性,分離鑒定出一株高產酒精酵母,研究其發酵過程中的發酵特性,對提高米酒釀酒工業的發酵效率和產品質量,具有很重要的意義。

本研究從酒曲中分離篩選得到一株適用于釀造米酒的酵母,通過研究其葡萄糖發酵特性,為該酵母菌與其他具有特性功能菌株混合制成復合發酵菌用于酒類釀造提供直接或間接的依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

酒曲 廣西象州某酒餅廠、桂林某酒廠和河池某酒廠。

高產酒精酵母(編號GJ2008)、產香扣囊腹膜酵母(編號YW12) 均為本實驗室保藏菌種。

YEP液體培養基:酵母膏10g,蛋白胨20g,用蒸餾水定容至1000mL；YPD培養基:YEP液體培養基加入葡萄糖,糖濃度為20g/L；YPD固體培養基:YPD培養基加入瓊脂,瓊脂濃度為20g/L；Glucose 50g/L；YEPD培養基:YEP培養基中加入葡萄糖50g/L；碳源同化基礎培養基、氮源同化基礎培養基、麥氏培養基和PDA培養基[3]；以上培養基115℃高溫蒸汽滅菌30min,待用；美蘭染色液:亞甲基藍0.1g,二水合檸檬酸三鈉20g,用蒸餾水定容至1000mL。

SBA-40C型生物傳感儀 山東科學院生物研究所；Motic DMB5數碼顯微鏡 上海捷辰儀器有限公司；K5500微量分光光度計 北京凱奧科技發展有限公司；高速冷凍離心機220R 德國赫擔馳公司；LS-B100立式高壓蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫療設備有限公司；LRH-250型生化培養箱 上海雷韻實驗儀器制造有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 酵母菌的分離純化 酵母菌的分離純化參考文獻[3]進行。

1.2.2 酵母菌的篩選 初篩:在無菌條件下,將通過分離純化得到的多株酵母菌用接種環分別接種于100mL無菌YPD液體培養基并置于30℃培養18～24h,然后按10%的接種量分別接入裝有100mL葡萄糖100g/L YEPD培養基的250mL小三角瓶中,30℃培養72h,每6h取一次樣,測量并繪出培養基中葡萄糖濃度曲線和酒精濃度曲線。篩選出發酵速率快、產酒精能力高和殘糖含量少的酵母菌。并結合感官評定(感官評定的方法按照GB/T10345-2007,并參考文獻[4]進行),淘汰產雜味物質的酵母菌。篩選出的酵母菌作為復篩的出發菌株(菌株的編號規則:從三個酒廠獲得的九種酒曲分別編號1、2、3、4、5、6、7、8、9,從1號酒曲篩選出的菌株依次編號1-1Y,1-2Y,1-3Y等,依次類推)。

復篩:實驗方法同初篩,只將葡萄糖100g/L YEPD培養基改為葡萄糖200g/L YEPD培養基。

1.2.3 酵母菌的生理生化實驗和26S rDNA序列鑒定實驗

1.2.3.1 生理生化實驗 菌落和細胞形態、菌絲的形成、擲孢子的形成、糖類發酵實驗、碳源同化實驗、硝酸鹽同化實驗、子囊孢子的形成、在高滲透壓培養基上的生長等實驗參考文獻[3,5-6],產生類淀粉化合物的測定參考文獻[7]。

1.2.3.2 26S rDNA序列鑒定實驗 PCR引物的選擇:選擇通用引物NL1(5′-GCATAT CAA TAA GCG GAGGAA AAG-3′)和NL4(5′-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3′)[8](上海英俊生物技術有限公司合成)。

PCR反應條件:94℃預變性5min,30個循環(94℃變性60s,53℃退火60s,72℃延伸60s)后,72℃延伸5min。將擴增目的產物膠回收,通過TA克隆將克隆序列送至上海英俊生物技術有限公司測序。將序列在NCBI數據庫中進行BLAST比對分析,使用MEGA 5.0軟件創建系統進化樹。

1.2.4 酵母菌5-1Y的葡萄糖發酵特性研究 酵母菌懸液的制備方法:按照1.2.2中初篩的方法培養好種子液后,在無菌環境下取40mL已經活化好的酵母培養液,置于50mL無菌離心管中,9000r/min離心10min,棄上清后加入40mL無菌水洗滌2次,以除去殘留的培養基。得到的菌體加入適量無菌水,充分振蕩后待用。

將已滅菌好的葡萄糖500g/L溶液加入YEP基礎培養基中,用無菌水配制成葡萄糖濃度分別為50、103、138、200、230、260、290和320g/L等濃度的YEPD培養基(每個梯度做兩個平行實驗),加入酵母菌懸液,使酵母菌濃度約為7×106cells/mL。放入恒溫培養箱,于30℃、160r/min恒溫振蕩培養72h,期間每隔一定時間取樣1mL,9000r/min離心10min,上清液用SBA-40C型生物傳感儀測定殘葡萄糖濃度和乙醇濃度。離心后的酵母菌菌體用水補足1mL并充分振蕩,取該菌懸液100μL,經美蘭染色后,利用血球計數板法測出酵母菌細胞數和死亡數[9],另取該菌懸液用分光光度計測出菌懸液的OD560值。

2 實驗結果與分析

2.1酵母菌的分離與純化

將分離出的多株酵母菌分別接種于YPD固體培養基上,于25℃培養3d,菌落為乳白色圓形,較大的、邊緣鋸齒或整齊、高凸或低凸起、表面粗糙或光滑；菌體均為橢圓形,出芽生殖,有不同的發酵產酒精能力。根據《酵母菌的特征與鑒定手冊》[4],初步將這些菌定為酵母菌。

2.2酵母菌的篩選

2.2.1 酵母的初篩 通過測出發酵過程中二氧化碳失重、殘葡萄糖濃度速率和發酵酒精度,對選出的27株酵母菌進行發酵實驗。取11株有代表性的酵母菌作圖(GJ2008與YW12為對照菌株),這11株酵母菌的實驗結果見圖1A～圖1D:

從圖1A-圖D圖中可以看出,酒曲里面的酵母菌都具有發酵能力,但差別較大,故選用適宜的酵母菌菌種用于米酒生產,對提高產品的品質有著不可忽視的作用。

[10]可知:葡萄糖濃度-時間曲線下面積(AUC)與葡萄糖的利用成正比,它代表葡萄糖被利用的程度。因此在相同初糖濃度和時間AUC越小表示糖利用速率越快。對比本實驗室的高產酒精酵母(編號GJ2008),通過圖1A～圖C和表1可以看出,菌種GJ2008、1-1Y和5-1Y在相同YEPD培養基上酒精發酵效率高,糖利用率最快(發酵12h后,發酵液中的葡萄糖濃度達到最低,CO2失重不再增加,發酵即結束)；顯然,3-1Y、2-5Y和YW12等菌株的糖利用速率慢故被淘汰。3-1Y和2-5Y雖然發酵速率慢,酒精發酵效率較低,但發酵過程中耗糖曲線平緩,產香味物質明顯,具有產香酵母的一般性質,可能為產香酵母,故選1-1Y、5-1Y、3-1Y與2-5Y為復篩出發菌株。

表1 葡萄糖濃度-時間曲線下面積Table 1 The area under the glucose concentration-time curve(AUC)

注:表1中AUC的值是由圖1計算而來(AUC的值由軟件GraphPad-prism 5自動算出)。

表2 葡萄糖濃度-時間曲線下面積Table 2 The area under the glucose concentration-time curve(AUC)

2.2.1 復篩 測定了27株菌的部分發酵性能后,相同的方法對篩選出的4株菌種進行復篩,實驗結果如圖2A～圖2D所示。

圖1 酵母菌的初篩Fig.1 The preliminary screening of yeast strains

圖2 酵母的復篩Fig.2 The secondary screening of yeast

由表2A可知5-1Y、1-1Y的AUC數值小且接近,這說明兩株酵母發酵速率很快。從圖2A～圖2D中可以看出酒精酵母5-1Y與1-1Y的發酵速率很快(5-1Y、1-1Y和GJ2008的糖濃度曲線幾乎重合),酒精產率均很高,品嘗分數值比較理想,但由于1-1Y在用于釀酒時產CO2多,嚴重時會有泡沫溢出瓶口,給實驗處理帶來難度,因此選擇5-1Y作為目的產酒酵母菌進行下一步實驗。

2.3酵母菌的鑒定

2.3.1 酵母的生理生化實驗

2.3.1.1 5-1Y的菌落及生理特征 菌落較大,圓形,不透明,凸起,表面光滑,邊緣整齊,乳白色,單細胞個體為卵圓形,具有酒精酵母的一般特征；實驗未觀察到5-1Y形成菌絲；通過孔雀綠染色法,觀察到了綠色的子囊孢子,每個子囊里含有1-4個子囊孢子,孢子呈橢圓形；在擲孢子的形成實驗中未觀察到5-1Y有散落的擲孢子。5-1Y菌株在YPD培養基上培養14d后,滴入碘液,培養液未變藍色,說明5-1Y未產生類淀粉化合物；5-1Y菌株在含500和600g/L葡萄糖的YEPD培養基上均能長出菌落,表明5-1Y在高滲透壓培養基上能夠生長。

2.3.1.2 糖類發酵實驗 酵母在發酵時,常常會伴有二氧化碳的生成,生成的二氧化碳會部分溶解于發酵液,并從發酵液中逸出[11],因此采用“杜氏小管法”很難收集或收集不到這些發酵弱的菌株產生的氣體,為了進一步說明5-1Y菌株不發酵乳糖,將表3中含乳糖的培養基放大到200mL,發酵3d,發酵液沒有產生二氧化碳失重,發酵液不含乙醇,進一步說明該菌株不發酵乳糖。這與王鏡巖等人的結論一致[12]。

表3 5-1Y菌株糖類發酵結果Table 3 The fermentation of different sugars in 5-1Y

注:“+++”表示發酵強烈,“-”表示不發酵。

2.3.1.3 碳源和氮源同化實驗 由表4可知,5-1Y能夠利用除了乳糖以外的四種糖(果糖、麥芽糖、葡萄糖和蔗糖)作為營養物質進行細胞繁殖(菌體OD560值增加),表明5-1Y能同化果糖、麥芽糖、葡萄糖和蔗糖,但不能同化乳糖。此外,該菌株不同化硝酸鉀中的氮元素。

2.3.2 26S rDNA序列鑒定實驗 將5-1Y的26S rDNA D1/D2區序列通過BLAST在NCBI中的基因庫進行同源序列搜索,選取近親菌株的26S rDNA D1/D2序列進行比對,用MEGA 5軟件構建系統進化樹。如圖3所示:從圖3中可以看出:5-1Y與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)相似度達100%,因此可以確認5-1Y為釀酒酵母。

圖3 5-1Y的26S rDNA序列與相關菌株的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the 26S rDNA sequence in 5-1Y and its closest relatives注:括號里為GenBank的登錄號。

2.4酵母菌5-1Y的葡萄糖發酵特性研究

分別測定了殘葡萄糖、乙醇含量、酵母菌菌體OD560值及酵母菌的死亡率等的變化情況,結果如圖4所示。

圖4 不同初始糖濃度對酵母菌5-1Y發酵的影響Fig.4 Fermentation of different glucose content in 5-1Y

表5 葡萄糖濃度-時間曲線下面積Table 5 The area under the glucose concentration-time curve(AUC)

表6 不同初糖濃度酒精發酵結果Table 6 Fermentation result of different glucose content

圖4A和表6可以看出:發酵初糖濃度在230g/L以下時,發酵結束后殘糖濃度低于0.1g/L,培養基中的糖幾乎全部被酵母利用；而初糖濃度為320g/L時,發酵72h后的殘糖濃度為5g/L,稍微有點偏高,說明320g/L的初糖濃度不利于發酵。考慮到乙醇濃度太低,后續處理時難度和能耗成本增加,因此,在進行發酵時選擇200～230g/L的初糖濃度作為適宜的糖濃度進行發酵。

由圖4B可知,當發酵初糖濃度在0～138g/L范圍內時,酵母菌的菌體濃度與初糖濃度成正相關關系,可見糖是酵母菌增值的重要營養物質,糖濃度過低,則無法提供足夠的營養物供酵母菌繁殖。當發酵初糖濃度在200～320g/L范圍時,較高的滲透壓環境使酵母菌的生長繁殖受到抑制,致使酵母菌的菌體濃度與初糖濃度成負相關關系。圖4B中,酵母菌在320g/L的高初糖濃度培養基中培養時,細胞繁殖受到的抑制作用非常明顯。發酵將結束,每條曲線都顯示酵母的細胞數量都有些許下降,其中一個原因是由于發酵液中乙醇、脂肪酸和高級醇等代謝產物的累計,使酵母菌細胞機能變弱,進而導致細胞自溶[13],而自溶后,細胞自身的組成物質會在酶促的作用下生成大量的氨基酸、多肽、核苷酸、甘露糖蛋白和脂肪酸等物質對酒的品質都有著促進或相反的作用,因此,在釀酒時就需要合理引導和利用酵母自溶現象的發生方向[14]。

表5表明:初糖濃度為260g/L AUC是103g/L AUC的6.8倍,大于糖濃度比2.5(260/103=2.5),故總體上來看,初糖濃度越高發酵速率越慢。圖4C表明:發酵產酒精速率與發酵初糖濃度成反比例關系,初糖濃度越高,產酒精越緩慢。結合圖4C和4D可知:隨著發酵的進行,酒精濃度逐漸提高,酵母的增值能力越弱。酒精濃度達到約10°時,酵母的死亡率開始上升,這可能是由于酵母在發酵中產生的乙醇產物阻遏酵母自身細胞的增殖,改變細胞的活性,從而影響發酵速率和效率[15]。然而據Louiero和Ferreira[16]等人報道說:發酵液中的乙醇的濃度對細胞的毒性要遠小于發酵過程中酵母體內的乙醇濃度,因此導致酵母細胞死亡的最主要原因可能并不是發酵液中的乙醇濃度過高,而是酵母自身的生命周期。

從表6可以看出,初糖濃度在230g/L以內進行發酵時,酒精發酵效率為88%左右,變化不大。初糖濃度大于260g/L以后,其糖利用率雖然能達到99%,但是酒精發酵效率卻明顯開始下降,初糖濃度為320g/L時,酒精發酵效率只達到78.41%,與低濃度糖(50～230g/L)酒精發酵產率88%相差近10個百分點,糖利用率卻也能達到98.41%,這說明發酵過程中該酵母可能產生了其他代謝產物。

3 結論與展望

本文以酒曲為研究對象,從中分離出一株產酒精能力強的酵母菌,探索了不同糖濃度對乙醇發酵過程中該酵母的生長和發酵產酒精能力的抑制作用,確定了糖濃度對酵母菌性能的臨界濃度值。

通過測出發酵過程中糖濃度、酒精濃度和細胞濃度的變化曲線,可以較快篩選出高產酒精的酵母菌。篩選得到的5-1Y菌株的最佳初糖發酵濃度為230g/L,乙醇發酵效率為88.35%,糖利用率為99.9%,當繼續提高糖濃度大于臨界值260g/L后,由于受到糖濃度的顯著抑制作用,雖然乙醇濃度有所提升,但發酵效率降低,糖利用率仍能達到99.8～99.9%,繼續提高葡萄糖濃度對于酒精發酵無實際意義。

發酵產物乙醇對酵母的生長和發酵能力有明顯的抑制作用,如何降低乙醇對酵母菌的毒害作用和篩選出耐高濃度乙醇酵母是提高乙醇產量的關鍵。

不同的酵母產生的代謝產物不同,在發酵過程中產生的揮發性物質也是有所差異的[17-19]。將本實驗選出的一株釀酒酵母初步用于釀造米酒時,釀出的米酒酒味純正、邪味少,是一株具有釀酒潛力的高產酒精酵母。其釀造工藝還在進一步研究中。

參考文獻

[1]張中義,暢曉霞,鐘其頂.酒曲酶系、菌系特征及釀造過程中微生物動態變化[J].釀酒,2008,35(5):24-28.

[2]惠豐立,柯濤,褚學英,等.大曲中酵母菌種群結構及多樣性分析[J].食品與生物技術學報,2009,28(1):102-106.

[3]高玉妹,陶能國,劉躍進,等.白酒酒曲中9株酵母菌的分離與特性研究[J]食品工業科技,2010(5):195-201.

[4]李紀亮.孝感米酒感官品評體系的建立[J]. 釀酒,2003,30(6):93-96.

[5]巴尼特 J A,佩斯R W,亞羅D.酵母菌的特征與鑒定手冊[M].青島:青島海洋大學出版社,1991:18-31.

[6]呂紅線,王曉紅.釀酒酵母子囊孢子形成條件的研究[J].山東輕工業學院學報,1999,13(2):57-60.

[7]徐軍,羅慧波,崔德寶.大曲中酵母菌的分離及其鑒定[J].釀酒,2008,35(3):95-96.

[8]Baleiras Couto MM,Reizinho R G,Duarte FL. Partial 26S rDNA restriction analysis as a tool to characterise non-Saccharomyces yeasts present during red wine fermentations[J]. Int J Food Microbiol,2005,102:49-56.

[9]孔祥成,陳江,李曉聰,等.美蘭染色法檢測酵母活性的優化實驗[J].啤酒科技,2006(12):50-52.

[10]Zirkelbach JF,Jackson AJ,Wang Y,etal. Use of partial AUC(PAUC)to evaluate bioequivalence-a case study with complex absorption:methylphenidate[J]. Pharm Res,2013,30:191-202.

[11]王小紅,徐康,趙山,等.孝感鳳窩酒曲中酵母菌的分離及特性研究[J].現代食品科技,2008,(2)134-137.

[12]王鏡巖,朱圣庚,徐長發,等.生物化學[M]. 第三版.北京:高等教育出版社2002.

[13]寧正樣.酵母的自溶作用[J].食品科學,1991(12):16-20.

[14]李新榜,查巧玲,朱虹,等.酵母自溶及其對葡萄酒感官質量的影響[J].中外葡萄與葡萄酒,2008(4):42-45.

[15]Pratt P L,Bryce J H,Stewart G G. The effects of osmotic pressure and ethanol on yeast viability and morphology[J]. Institute of Brew,2003,109(3):218-228.

[16]Loureiro V,Ferreira H G. On the intracellular accumulation of ethanol in yeast[J]. Biotechnol,Bioeng,1983,25:2263-2269.

[17]Antonelli A,Castellari L,Zambonelli C,etal. Yeast influence on volatile composition of wine[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1999,47:1139-1144.

[18]Regodon Mateos J,Perez-Nevado F,Ramirez Fernandez M,etal. Influence of Saccharomyces cerevisiae yeast strain on the major volatile compounds of wine[J]. Enzyme Microb Technol,2006,40:151-157.

[19]Romano P,Fiore C,Paraggio M,etal. Function of yeast species and strains in wine flavor[J]. Int J Food Microbiol,2003,86:169-80.

Isolation,identification and glucose fermentative characterization of high alcohol yield yeast from rice wine starter

WUBao-long,WUShi-hua*,HEJing-jing,YINGLing-yun,YIYi,HUANGCui-ji

(School of Biological and Chemical Engineering,Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou 545006,China)

In this paper,27 yeasts were isolated from the local wineries and one strain with strong capacity of producing alcohol,named 5-1Y,was screened. The isolate was identified as Saccharomyces cerevisiae by morphology,biochemical tests and 26S rDNA analysis. The glucose concentration and the mortality of the isolate were detected continuously in YEPD medium,which contained various concentrations of glucose(50～320g/L),to analyze the fermentation characterization of this yeast. The results revealed that high concentration of initial sugar could affect the fermentation,and the suitable glucose concentration for 5-1Y was 230g/L.

rice wine starter;identification;fermentative characterization

2014-01-08 *通訊聯系人

伍保龍(1987-),男,在讀碩士研究生,研究方向:微生物代謝控制發酵。

廣西科技攻關項目(桂科攻0782003-2)；廣西科技大學科學基金(校科自1307105)。

TS

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001