重組人血管內皮抑素聯合順鉑體外干預人胃癌細胞生長的研究

鄧建良,談華陽,王維民,周 炎,許春妮,張國強

(江蘇大學附屬宜興市人民醫院醫院腫瘤科,江蘇宜興,214200)

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一,在中國,胃癌的發生率和病死率均居惡性腫瘤前列。目前,臨床上手術切除是治療早期胃癌的最有效手段,但研究[1]發現,術后腫瘤復發率高達50%～70%,且患者生存獲益也低于預期,5年生存率僅為20%～50%,進展期胃癌患者預后不佳,平均生存期6～8個月,通過化療平均可以延長3～6個月。目前,鉑類藥是治療胃癌的常用藥物。順鉑作為第3代鉑類化合物,已被證實在對抗多種惡性腫瘤化療中具有良好的療效,含順鉑的方案治療胃癌總體有效率為38%～54%[2]。重組人血管內皮抑素注射液(恩度)是中國學者自主研發的一類生物新藥,也是全球首個成功用于臨床的血管內皮抑素類藥物。其能與血管內皮細胞上的多個位點進行特異性的結合,阻斷其分子信號通路,通過抑制內皮細胞增殖和誘導期凋亡來抑制新生血管生成,從而抑制腫瘤組織生長。本研究擬通過恩度聯合順鉑作用于人胃癌細胞株SGC7901和BGC823,以初步探討其對人胃癌細胞增殖與凋亡的機制,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑:順鉑(德州德藥制藥有限公司產品,批號:120306);重組人血管內皮抑制素注射液(山東先聲麥得津生物制藥有限公司,國藥準字:S20050088);鼠抗人Bcl-2、Ki-67單克隆抗體(美國Santa Cruz公司);RPMI細胞培養基1640、胰蛋白酶和胎牛血清(美國Gibco lifetechologies公司);二甲基亞砜 DMSO和四甲基偶氮唑鹽(MTT,美國Sigma公司);Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(美國biovision公司);丙烯酰胺和N,N,-甲叉雙丙烯酰胺(上海生工生物工程公司);人胃癌細胞株SGC7901和BGC823(中國科學院上海生命科學研究院)。儀器:550型酶標儀(美國Bio-Rad公司);DY 602V穩流穩壓電泳儀(江蘇南達生物技術開發公司);TS-1型脫色搖床(江蘇海門市麒麟醫用儀器廠);CO2培養箱(德國Heraeus公司);FACS Vantage SE型流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:將人胃癌細胞株BGC823和人胃癌細胞株SGC7901培養在RPMI1640細胞培養基中,置于37℃、5%CO2培養箱內恒溫培養,每3 d或細胞鋪滿瓶底后,用0.25%胰蛋白酶消化。

1.2.2 細胞增殖抑制率測定:MTT法測定單藥組(僅適用順鉑)和聯合組(恩度聯合順鉑)對人胃癌細胞BGC823和人胃癌細胞SGC7901增殖的影響,具體步驟如下:取處于對數生長期的人胃癌細胞,用0.25%胰蛋白酶消化,用培養基將細胞吹打為單細胞懸液,調整懸液濃度為5×104個細胞/mL,并將其加至96孔板中。實驗設陰性對照組(設3孔平行),陽性對照組(設3孔平行)和實驗組,其中實驗組又分為單藥組和聯合組,且每種藥物濃度梯度均設3孔平行,將96孔板置于37℃、5%CO2培養箱中恒溫培養24 h。單藥組分別將 1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L的順鉑加入到96孔板內;聯合組在單藥組基礎上再加入100 mg/L的恩度注射液。37℃恒溫培養24 h后,每孔加入5 mg/mL的MTT后,再置于5%CO2培養箱中37℃恒溫培養4 h,2 000 r/min離心5 min,棄去上清,每孔再加入 200 μ L的 DMSO,輕輕混勻 10 min,在570 nm下檢測光密度值(OD)值。通過OD值分別計算單藥組和聯合組對人胃癌BGC823細胞和人胃癌SGC7901細胞的增殖抑制率。公式如下:細胞增殖抑制率=(1-實驗組 OD值均數/對照組OD值均數)×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率:實驗設細胞對照組、單藥組(單用順鉑)和聯合組(恩度聯合順鉑),單藥組選取上述實驗中單用順鉑增殖抑制率(fa)為0.5時的藥物濃度作為處理濃度,聯合組則選取上述實驗恩度和順鉑聯合應用時增殖抑制率為0.5時的藥物濃度作為處理濃度。取處于對數生長期的人胃癌細胞,用0.25%胰蛋白酶消化,用培養基將細胞吹打為單細胞懸液,調整懸液濃度為2×105個細胞/mL,并將其接種于50 mL培養瓶中,置于37℃、5%CO2培養箱中恒溫培養24 h,2 000 r/min離心5 min,棄去上清,分別單用順鉑和采用恩度聯合順鉑進行處理,37℃恒溫培養24 h,0.25%胰蛋白酶消化后收集細胞,檢測在上述藥物濃度下的細胞凋亡率。

1.2.4 蛋白Bcl-2和Ki-67表達的檢測:Western blot檢測Bcl-2、Ki-67的蛋白表達。采用 BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定所收集樣品中的蛋白濃度。進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,用5%的β-巰基乙醇處理樣品,沸水浴5 min,使待測樣品充分變性后,每份樣品點樣 50 μ g蛋白,100 V恒壓電泳100 min。將檢測蛋白轉膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,將轉膜槽置于冰浴中,60 V下電泳2 h。轉膜后用5%脫脂牛奶在室溫下將膜封閉100 min,用TBS緩沖液洗膜3次,10 min/次。再將膜與一抗置于4℃下孵育過夜。取出并洗膜,用5%脫脂牛奶稀釋二抗,將膜與相應的二抗置于室溫下,孵育100 min后,取出并洗膜。取等量的ECL發光劑A、B,將其混勻后滴在膜上,棄去殘余發光劑,將膜置于X光片夾中下,先將X片進行顯影后再進行定影,將膠片進行掃描。

2 結 果

2.1 單藥組和聯合組對BGC823和SGC7901細胞的抑制作用

單藥組和聯合組對人胃癌BGC823細胞株和人胃癌SGC7901細胞株的抑制作用在一定范圍內均隨藥物濃度的增加而增強;在3個濃度梯度上,聯合組的抑制作用均強于單藥組。見表1。

2.2 單藥組和聯合組半數抑制濃度比較

單藥組對BGC823細胞的IC50為20.77mg/L,聯合組IC50為9.66 mg/L;單藥組對SGC7901細胞的IC50為30.30mg/L,聯合組IC50為11.55 mg/L。單藥組對 BGC823細胞和SGC7901細胞的IC50均低于聯合組。

表1 2組對BGC823細胞和SGC7901細胞的制率比較(n=3, ±s)

表1 2組對BGC823細胞和SGC7901細胞的制率比較(n=3, ±s)

與單藥組比較,＊P<0.05,＊＊P<0.01。

組別 濃度/(mg/L)BGC823細胞抑制率/%SGC7901細胞抑制率/%單藥組 1 12.73±3.08 10.65±3.12 10 33.92±3.42 31.82±3.58 100 75.67±4.15 68.69±4.50聯合組 1+100 18.16±2.82 19.14±2.53＊10+100 45.37±4.24＊ 50.23±4.12＊＊100+100 85.39±5.16 76.59±3.88

2.3 各組對BGC823和SGC7901細胞凋亡的影響

BGC823細胞對照組、單藥組及聯合組的凋亡率分別為(2.02±0.35)%、(15.57±2.12)%、(19.88±3.32)%;SGC7901細胞對照組、單藥組及聯合組的凋亡率分別為(1.88±0.29)%、(13.33±3.05)%、(18.26±3.58)%。聯合組對誘導BGC823和SGC7901細胞的凋亡率有高于單藥組的趨勢,且顯著高于對照組,差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1、2。

圖1 誘導BGC823細胞的凋亡情況

圖2 誘導SGC7901細胞的凋亡情況

2.4 蛋白印跡法結果

蛋白印跡結果顯示,單藥組與聯合組分別對BGC823細胞和SGC7901細胞的Bcl-2和 Ki-67蛋白表達有所下調,且聯合組下調程度顯著大于單藥組(P<0.05),見圖3、4。

3 討 論

順鉑瘤譜較廣,對胃癌、腸癌、頭頸部癌、食管癌等均有效,且患者對不良反應的耐受性明顯提高[3-6]。盡管采用含順鉑的化療方案治療后療效有了一定提高,但腫瘤患者的生存獲益仍沒有明顯改善,對于晚期胃癌患者的治療尤其如此,所以亟須探索新的治療理念及治療方法。目前,在臨床工作中,抗血管生成治療已逐漸成為研究的熱點,國內外已采用多種作用于不同位點的血管生成抑制劑類新藥用于晚期腫瘤的治療。

隨著分子生物學和轉化醫學研究的不斷發展,關于胃癌的發病機制、分子信號通路和治療靶點的研究也有了進一步發現。目前,臨床上已取得一些突破,如運用西妥昔單抗[7]、貝伐單抗[8]和曲妥珠單抗[9]等具有明確靶點的單克隆抗體類生物藥聯合傳統化療治療進展期胃癌。恩度是一種多靶點的血管生成抑制劑,研究[10]表明,其能特異性地作用于血管內皮細胞表面的受體,通過抑制內皮細胞的增殖和遷移,誘導內皮細胞的凋亡來發揮抑制新生血管生成的作用。此外,恩度還能通過下調血管內皮生長因子(VEGF)的表達及抑制基質金屬蛋白酶的活性來抑制新生血管的生成,并可間接誘導腫瘤休眠或退縮[11]。臨床上,恩度聯合化療已用于多種晚期實體腫瘤的治療,且其與化療聯合治療胃癌已取得了良好的療效[12-14]。

圖3 BGC823細胞Bcl-2蛋白的表達

圖4 SGC7901細胞Bcl-2蛋白的表達

恩度聯合化療藥物用于胃癌治療的基礎研究較少?；谠鰪娀煰熜c減輕化療相關的不良反應,作者設計了此項恩度聯合順鉑干預胃癌細胞生長的體外實驗,并以檢測Bcl-2及Ki-67蛋白作為細胞增殖與凋亡的指標。通過檢測Ki-67、Bcl-2蛋白表達發現,順鉑聯合恩度作用于SGC7901及BGC823細胞時,其下調 Bcl-2、Ki-67表達的作用顯著優于單用順鉑。本研究結果提示,恩度可增敏順鉑,抑制胃癌細胞 BGC823及SGC7901細胞的增殖,促進其凋亡,作用機制是增強誘導細胞發生凋亡和抑制細胞增殖,這為恩度治療胃癌提供可靠的實驗依據。

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