環磷酰胺對實驗性自身免疫性葡萄膜炎的療效觀察

王兵

葡萄膜炎病因復雜，類型繁多，主要累及葡萄膜、視網膜血管、視網膜及玻璃體等組織，占致盲眼病的第3～7位[1]，葡萄膜炎病程較長，主要發生于青壯年，嚴重影響患者的生活質量，危害性很大[2]，環磷酰胺對CD4淋巴細胞有明顯抑制作用，并通過抑制體液免疫降低了外周淋巴細胞IL-17的表達[3]從而起到治療葡萄膜炎的作用。本研究通過對比分析環磷酰胺治療EAU的資料，來探討環磷酰胺對EAU治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取SPF級雄性動物Lewis大鼠54只,周齡6～8周，體重150～180g(北京維通利華實驗動物技術有限公司提供)。所有動物均按照視覺與眼科學研究協會中關于使用動物進行眼科與視覺研究的要求進行飼養和處理。使用過程中遵循天津市科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。

1.2 主要試劑和儀器 牛S抗原，蘇木精液；PH7.4，0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)；聚合HRP標記羊抗兔IgG、DAB；弗氏完全佐劑(complete Freund adjuvant， CFA)；白喉-破傷風-百日咳菌苗；規格為1.5ml Eppendorf管；裂隙燈顯微鏡及照相系統(日本Olympic公司BX51型400倍光學顯微鏡)；電腦全自動組織脫水機；濃度20g/L環磷酰胺液。

1.3 方法

1.3.1 誘導劑的配置 誘導劑的配置：取15mg牛S抗原溶解于15ml PBS緩沖液中，過濾、除菌，抽取等量濃度為lmg/ml的牛S抗原溶液與弗氏完全佐劑混勻乳化。混勻1h后，將乳化成功的溶液放置于冰塊上，待用。

1.3.2 EAU模型制作和分組 采用隨機數字法將所有大鼠隨機分為實驗組和正常對照組，其中實驗組大鼠48只，正常對照組6只。實驗組：取30μg制備好的誘導液，在大鼠雙后足墊皮內注射，同時腹腔內注射白喉-破傷風-百日咳菌苗0.1ml。正常對照組：在大鼠雙后足墊皮內注射等量的生理鹽水。造模3d后每天裂隙燈顯微鏡下觀察大鼠眼內炎癥反應情況，判斷造模是否成功。

1.3.3 環磷酰胺治療 采用隨機數字法將實驗組大鼠隨機平均分為環磷酰胺組和空白對照組，各24只。環磷酰胺組：大鼠于造模成功后每天相同時間點，在大鼠尾靜脈注射1ml環磷酰胺(20g/L)，連續注射3d；空白對照組：大鼠于造模成功后每天相同時間點，在大鼠尾靜脈注射1ml生理鹽水，連續注射3d，根據Caspi[4]臨床分級進行評分。

1.4 統計學方法 所有數據采用SPSS17.0統計學軟件進行處理，眼內炎癥反應臨床分級評分以中位數和四分位數表示，采用非參數Mann-Whitney U檢驗進行統計學比較。其余數據數據以均數±標準差()表示，采用單因素方差分析和兩隨機樣本的t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠眼前節裂隙燈顯微鏡觀察炎癥反應情況和Caspi臨床分級評分 正常對照組：發現房水清、虹膜紋理清晰、瞳孔圓、對光反射良好，未見明顯異常；其Caspi臨床分級評分均為0級。

空白對照組：造模后6天開始出現EAU炎癥癥狀，此時觀察到主要的炎癥表現為房水閃輝、晶狀體前囊灰白色點狀沉著物、虹膜血管輕度充血、擴張等；造模后9天 EAU炎癥癥狀加重，主要的炎癥表現為房水閃輝加重，瞳孔對光反射消失、瞳孔縮小等；造模后12天 EAU炎癥癥狀最嚴重，主要的炎癥表現為前房變淺甚至消失、瞳孔發生閉鎖、前房積膿，能擴大瞳孔者可見玻璃體內密集的團狀混濁；造模后第15天 EAU炎癥癥狀有所減輕；造模后第18天炎癥癥狀明顯減輕。

環磷酰胺組：造模后第8天開始出現EAU炎癥癥狀，隨后炎癥反應逐漸加重，至造模后第12天最重，其后逐漸減輕，造模后第18天 EAU炎癥癥狀明顯減輕，但各時間點的嚴重程度明顯低于空白對照組。

2.2 空白對照組和環磷酰胺組不同時間點大鼠Caspi臨床分級評分比較 見表1。環磷酰胺組造模后第6、9、12和18天大鼠眼內炎癥反應Caspi臨床分級評分均顯著低于空白對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。而正常對照組Caspi臨床分級評分均為0級。

表1 兩組不同時間點大鼠Caspi臨床分級評分比較

3 討論

本實驗提示牛S-Ag和CFA等量混合可成功誘導Lewis大鼠成功制造EAU模型。其機制可能為牛S-Ag和CFA等量混合抗原可誘導反應性T細胞大量增殖為Thl或Thl7細胞，這些激活的效應T細胞隨血流到達眼內組織，識別與其同源的抗原，并激活下游信號，導致血眼屏障的破壞，炎癥細胞的浸潤繼而炎癥發展為葡萄膜炎[5]。

大鼠眼前節裂隙燈顯微鏡下觀察，空白對照組免疫第6d開始出現EAU炎癥癥狀、12天 EAU炎癥癥狀最嚴重、造模后15天 EAU炎癥癥狀有所減輕、造模后第18天 EAU炎癥癥狀明顯減輕。環磷酰胺組造模后第8天開始出現EAU炎癥癥狀，隨后炎癥反應逐漸加重，至造模后12天最重，其后逐漸減輕，造模后第18天 EAU炎癥癥狀明顯減輕，但各時間點的嚴重程度明顯低于空白對照組。說明造模成功后12天 EAU病情最嚴重，眼內炎癥反應達到最高峰。隨時間推移兩組都在18天趨向好轉，說明EAU具有自限性，印證了葡萄膜炎是自身免疫性疾病這一觀點。在不同時間點環磷酰胺組的炎癥反應及均低于空白對照組，說明環磷酰胺能抑制EAU反應過程中炎性介質的釋放。其機制可能為抑制CD4+細胞亞群CD17細胞的細胞因子IL-17的表達，抑制了葡萄膜炎的發生、發展[6]。

環磷酰胺是一種烷化劑，是應用最廣的氮芥類衍生物，代謝在肝臟進行，其不良反應主要為肝功能、腎功能損壞、出血性膀胱炎、血細胞異常等，臨床上多用于抗腫瘤治療。

研究表明，環磷酰胺對CD4淋巴細胞有明顯抑制作用[7]，并通過抑制體液免疫降低了外周淋巴細胞的表達，可以治療非感染性和多種類型的難治性葡萄膜炎，主要用于糖皮質激素或其他免疫抑制劑無反應的頑固性眼病患者[8]，本研究選取環磷酰胺，考慮其能通到免疫學機制影響葡萄膜炎的進程，減輕大鼠葡萄膜炎病變程度，改善葡萄膜炎病情。其原因可能為環磷酰胺通過與DNA鳥嘌呤的第七位氮發生持久的交叉打結，導致DNA編碼錯誤，使細胞的DNA在分裂過程中不能分裂，最終導致細胞死亡[9]。

總之，雖然環磷酰胺能夠減輕大鼠葡萄膜炎病變程度，改善葡萄膜炎病情，為我們治療葡萄膜炎提供了新的治療方法。

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[3]袁立飛，張曉敏，李光速，等.間充質干細胞對大鼠實驗性自身免疫性葡萄膜炎視網膜中白細胞介素17表達的影響[J].中華實驗眼科雜志，2012，30(5)：392-396.

[4]Caspi RR.Thl and Th2 responses in pathogenesis and regulation of experimentaI autoimmune uveoretinitis[J].1nt Rev Immun01,2002,21(23):197-208.

[5]唐搖紅，蔡莉萍，張愉.調節T細胞與葡萄膜炎的研究進展[J].國際眼科雜志，2011，11(3)：450-452.

[6]徐曉芳，呂嘉華.酪氨酸酶相關蛋白誘導實驗性自身免疫性葡萄膜炎的臨床和病理特點[J].中華眼科雜志，2008，24(5)：373-377.

[7]盧弘.糖皮質激素與環磷酰胺聯合應用治療葡萄膜炎[J].中華眼底病雜志，1996，12(4)：247-248.

[8]周增超，王紅，彭曉燕，等.細胞因子信號抑制因子在實驗性自身免疫性葡萄膜視網膜炎外周血單個核細胞內的表達變化[J].中華眼科雜志，2008，24(5)：340-344.

[9]梁亮，王紅，彭曉燕，等.IL-17在實驗性自身免疫性葡萄膜炎大鼠模型眼部的表達[J].眼科研究，2010，28(4)：315-318.