順鉑對耐紫杉醇卵巢癌細胞亞系SKOV3-TR30生物學功能的影響

劉文娟 宮玉典

卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤之一，其致死率為癌癥總致死率的5%，嚴重威脅女性健康[1]。目前，卵巢癌的主要治療方法為化療，使用的一線藥物有紫杉醇，鉑類等[2]。研究顯示卵巢癌患者對紫杉醇及鉑類藥物治療有較好的反應性，使用之初可明顯抑制或緩解，但患者在持續治療之后病情會惡化或復發，從而導致死亡。持續使用藥物一段時間患者的病情加重與腫瘤細胞的耐藥性相關，腫瘤細胞對這些化學治療藥物耐受，這些化學治療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用下降或消失，最終導致患者應藥物耐受而死亡。順鉑是治療卵巢癌的重要化療藥，本研究使用耐紫杉醇的卵巢癌細胞SKOV3-TR30為研究對象，觀察順鉑對其生物學功能的影響，探討SKOV3-TR30耐順鉑的主要機制，為SKOV3-TR30耐藥性的逆轉提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 材料 人卵巢上皮細胞癌細胞株SKVO3購自美國模式菌種收集中心（ATCC），使用中等劑量間隙結合低劑量維持的方法誘導建立SKOV3-TR30，使用含紫杉醇的McCOY’5A培養基對SKOV3-TR30進行培養傳代，使用時將SKOV3-TR30用不含紫杉醇的McCOY’5A培養基培養3周。順鉑購自山東齊魯制藥有限公司，MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5二苯基四氮唑溴鹽)，細胞周期試劑盒和凋亡試劑盒均購于森貝伽（南京）生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞周期檢測將SKOV3及SKOV3-TR30細胞接種6孔板，保持每孔細胞數4×105/ml，37℃，5%CO2培養24h后換液，分別加入順鉑濃度為25.65、56.82μmol/L（此濃度為該細胞藥物的半抑制濃度）的培養液培養48h，使用細胞周期試劑盒進行細胞周期檢測。

1.2.2 細胞凋亡率檢測 將SKOV3及SKOV3-TR30細胞接種 96 孔板，5%CO2培養 12、24、36、48h后換液，分別加入順鉑濃度為25.65、56.82μmol/L（此濃度為該細胞藥物的半抑制濃度）的培養液培養24h，之后加入MTT每孔20μl，37℃、5%CO2培養4h，每孔加入DMSO 200μl，使用酶標儀測定波長540nm處每孔吸光度。細胞凋亡率=（加藥細胞吸光度-對照細胞吸光度）/對照細胞吸光度×100%。

1.3 統計學方法 應用SPSS16.0統計軟件進行統計學分析。計量資料用均數±標準差（)表示，使用方差分析（Oneway ANOVA)分析各組組間差異，計數資料的組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 順鉑對SKOV3，SKOV3-TR30細胞周期的影響 圖1、圖2為流式細胞法檢測細胞周期結果，結果顯示未加藥時SKOV3，SKOV3-TR30主要分布與G0/G1期，兩者細胞數比較差異無統計學意義，順鉑處理48h后，各加藥細胞與其未加藥的細胞比較G0/G1期細胞均減少，且與未加藥細胞比較，細胞數差異有統計學意義（P＜0.05），但SKOV3的減少幅度大于SKOV3-TR30（P＜0.05），兩者均停留于G2/M期，且SKOV3 滯留于G2/M期細胞的增加幅度大于SKOV3-TR30（P＜0.05）。

圖1 未加藥細胞周期測定結果

圖2 加藥后細胞周期測定結果

2.2 順鉑對SKOV3，SKOV3-TR30細胞凋亡的影響表1為順鉑對SKOV3、SKOV3-TR30細胞凋亡的影響，結果顯示，順鉑作用 0、12h時，SKOV3、SKOV3-TR30 細胞凋亡差異無統計學意義，順鉑作用 24、36、48h，SKOV3、SKOV3-TR30細胞凋亡與之前相比明顯增多（P＜0.05），且SKOV3凋亡細胞比例明顯高于SKOV3-TR30，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 順鉑對SKOV3，SKOV3-TR30 細胞凋亡的影響（%，）

表1 順鉑對SKOV3，SKOV3-TR30 細胞凋亡的影響（%，）

注：與0h比較，aP＜0.05,與同時間點SKOV3-TR30比較，bP＜0.05

時間 SKOV3 SKOV3-TR30 0h 8.47±2.15 8.16±2.27 12h 20.48±2.36 21.85±2.41 24h 48.57±4.29ab 31.62±4.72a 36h 64.28±4.67ab 41.91±5.71a 48h 87.26±6.27ab 54.62±6.19a

3 討論

SKOV3-TR30為耐紫杉醇的人卵巢上皮細胞癌細胞株。已有研究認為腫瘤細胞耐紫杉醇的記住主要如下，細胞膜上存在轉運蛋白如P-gp，這些蛋白將細胞中的藥物轉運至細胞外，從而降低藥物在細胞中的濃度；腫瘤細胞微管的異常，如微管蛋白突變等[3]；藥物作用靶點的改變，從而導致藥物起作用的細胞信號通路改變[4]；紫杉醇耐藥相關基因表達的異常[5]。

本研究中順鉑處理48h后，SKOV3、SKOV3-TR30加藥細胞與未加藥的細胞比較G0/G1期細胞均減少，且SKOV3的減少幅度大于SKOV3-TR30，說明順鉑均可影響SKOV3、SKOV3-TR30細胞的周期，且對SKOV3的影響大于SKOV3-TR30。順鉑作用 24、36、48h，SKOV3、SKOV3-TR30細胞凋亡與之前相比明顯增多，且SKOV3凋亡細胞比例明顯高于SKOV3-TR30，說明隨著順鉑作用時間的延長，其對SKOV3和SKOV3-TR30細胞凋亡的影響越大，且對SKOV3細胞的凋亡作用大于SKOV3-TR30細胞。本研究結果顯示SKOV3-TR30對順鉑存在一定耐藥性，這可能是由于細胞的多藥耐藥引起。

[1]林淑君,許慎,蔡友鵬.洛鉑聯合化療治療復發性卵巢癌的臨床觀察[J].當代醫學,2011,17(6):65.

[2]張瑞平,董霖.卵巢癌患者應用紫衫醇聯合卡鉑方案的觀察和護理[J].當代醫學,2010,16(7):108-109.

[3]Xia W,Low PS.Folate-targeted therapies for cancer[J].J Med Chem,2010,53（19）:6811-6824.

[4]石云,段振玲,徐琳,等.順鉑誘導卵巢癌SKOV3細胞自噬和凋亡的研究[J].現代婦產科進展,2011,20（1）:45-47.

[5]段愛紅,王輝,陳俊麗.洛鉑誘導卵巢癌細胞SKOV3凋亡的研究[J].中國熱帶醫學,2009,9(7):1214-1215.