鼻咽癌中環氧化酶—2的實驗研究

陳廣理　王俊周　郭曉民　等

【摘要】 目的 研究環氧化酶-2在鼻咽癌中的表達， 探討其與鼻咽癌的增生、浸潤及轉移的關系。方法 在26例鼻咽癌及相應癌旁組織和10例正常鼻咽部黏膜組織中， 應用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法檢測環氧化酶-2 mRNA的表達。結果 在鼻咽癌組織中環氧化酶-2 mRNA高表達， 在正常鼻咽部黏膜環氧化酶-2 mRNA中低表達， 差異具有統計學意義（P<0.01）。結論 環氧化酶-2與鼻咽癌的生長、浸潤及轉移有密切關系。

【關鍵詞】 鼻咽癌；環氧化酶-2；逆轉錄-聚合酶鏈反應

環氧化酶-2（cyclooxygenase-2， COX-2）是前列腺素（PGs）合成過程中主要限速酶， 不僅在炎癥等過程中發揮重要作用， 而且還與腫瘤的增生、浸潤和轉移密切相關[1]。鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma， NPC）是具有極高的浸潤和轉移能力的腫瘤本實驗通過RT-PCR方法研究在鼻咽癌中COX-2的表達， 探討COX-2在鼻咽癌的增生、浸潤及轉移中的作用。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 鼻咽癌及相應癌旁組織26例， 來源于本院鼻咽部活檢標本， 其中有淋巴結轉移病例19例、無淋巴結轉移病例7例。癌旁組織取自腫瘤邊緣5 mm以外區域， 10例正常鼻咽部黏膜組織取于鼻咽部正常的手術患者。病理學診斷均為鱗狀細胞癌， 其中高分化3例、中分化4例、低分化19例。其中男19例， 女7例， 年齡最小27歲， 最大78歲， 平均年齡（48.026±5.517）歲， 術前均未經化療或放療。

1. 2 主要試劑與儀器 逆轉錄酶MLV（MBI）， TRIzol試劑（GibCO）， dNTP（MBI）， TaqDNA聚合酶（MBI）， GDS8000型凝膠成像系統（UVP）， PTC-200 PCR儀（MJA）， Grab-it 4.0分析軟件為Gelworks 1D interdiate， DU650型紫外光分光光度儀（BECKMAN）。

1. 3 引物設計 泳道M：Marker；泳道1～2分別是COX-2 mRNA在無淋巴結轉移的鼻咽癌組織和有淋巴結轉移鼻咽癌組織中的PCR產物（236 bp）；泳道3～4分別是COX-2 mRNA在癌旁組織和正常鼻咽部黏膜中的PCR產物（236 bp）。

1. 4 組織RNA提取和cDNA合成 取約50 mg組織放入勻漿器中， 勻漿加入1 ml TRIzol， 用氯仿和異丙醇逐步提取RNA， 溶于焦碳酸二乙脂水中， 然后應用紫外分光光度儀檢測定量。

1. 5 RT-PCR反應 以cDNA為模板， 擴增COX-2 （236 bp）及β-actin （300 bp）等基因片斷。

PCR反應體系為25 μl， 含上述基因cDNA 2.0 μl， dNTP 的終濃度0.2 mmol/L， 10×Buffer 2.5 μl， Mg2+的終濃度2.0 mmol/L， TaqDNA聚合酶1 U， 上游和下游引物的終濃度各0.2 μmol/L。β-actin為內參照物。

PCR反應條件為95℃預變性5 min， 95℃ 1 min、50℃ 1 min、72℃ 1 min， 然后72℃延伸5 min。反應結束后取5 μl產物電泳， 用grab-It成像系統照像， 然后分析各條帶的積分吸光密度值， 以目的基因與β-actin的相對積分吸光密度值記錄結果。

1. 6 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件對數據進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2. 2 在鼻咽癌癌旁組織和正常鼻咽部黏膜中COX-2 mRNA低表達， 見圖1， 相對平均吸光度值分別為：（0.2069±0.0372）、（0.2183±0.0417）。二值差異無統計學意義（t=1.358， P>0.05）。

2. 3 在鼻咽癌組織中COX-2 mRNA的表達與在正常鼻咽部黏膜COX-2 mRNA的表達之間， 差異均具有統計學意義（P<0.01）。

3 討論

鼻咽癌為我國最常見的惡性腫瘤之一， 是極易轉移的腫瘤， 通常頸淋巴結轉移常為患者最早發現的體征， 頸部腫塊為此病首發者約占60%。COX-2在正常組織中不表達或微量表達， 而在病理情況下， COX-2在炎癥、腫瘤等組織中表達增高， COX-2的高表達與多種腫瘤的發生發展關系密切[1]。本實驗檢測表明， COX-2在鼻咽癌組織中均高表達， 在癌旁組織和正常鼻咽部黏膜中低表達。本實驗結果表明， 鼻咽癌的增長、浸潤及轉移與COX-2的高表達有密切的關系。

3. 1 COX-2促進腫瘤新生血管的形成血管內皮生長因子（VEGF）是促進腫瘤新生血管生成的作用最強的因子之一。在腫瘤中高表達的COX-2可促使VEGF生成增加， COX-2與VEGF協同作用， 促進腫瘤新生血管的生成[2]。文獻報道， 在鼻咽癌中VEGF高表達， 鼻咽癌的失控增殖能力與VEGF的高表達有密切關系。結合本實驗結果， 在鼻咽癌組織中COX-2高表達， 表明COX-2與VEGF共同促進鼻咽癌新生血管的生成。

3. 2 COX-2促進腫瘤細胞的增殖 在腫瘤中COX-2高表達， 促進腫瘤合成大量PGs， 進而促進腫瘤細胞增殖[3]。結合本實驗結果， COX-2在鼻咽癌組織中均高表達， 表明COX-2促進了鼻咽癌細胞的增殖。

3. 3 COX-2促進腫瘤的浸潤和轉移 研究表明， 在腫瘤組織中COX-2表達增高， 同時有基質金屬蛋白酶-2和基質金屬蛋白酶-9的表達升高， E-鈣粘連素的表達降低， 共同促進了腫瘤細胞的浸潤和轉移。鼻咽癌是具有極高浸潤和轉移能力的腫瘤， 本實驗結果顯示， COX-2在鼻咽癌組織中均高表達， 表明COX-2促進了鼻咽癌細胞的浸潤和轉移。

綜上所述， 鼻咽癌中COX-2表達升高， 說明了鼻咽癌細胞的增生、浸潤及轉移與COX-2的高表達有密切關系。因此， COX-2成為了研究和治療腫瘤的重要靶分子之一， 在抗腫瘤的研究治療中有重要的意義。

參考文獻

[1] Fukazawa EM， Baiocchi G， Soares FA， et al. Cox-2， EGFR， and ERBB-2 Expression in Cervical Intraepithelial Neoplasia and Cervical Cancer Using an Automated Imaging System. Int J Gynecol Pathol， 2014， 33（3）：225-234.

[2] Nagoya H， Futagami S， Shimpuku M， et al. Apurinic/apyrimidinic endonuclease-1 is associated with angiogenesis and VEGF production via upregulation of COX-2 expression in esophageal cancer tissues. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol， 2014， 306（3）：183-190.

[3] Zhao H， Luo F， Li H， et al. Antinociceptive Effect of Tetrandrine on LPS-Induced Hyperalgesia via the Inhibition of IKKβ Phosphorylation and the COX-2/PGE2 Pathway in Mice. PLoS One， 2014， 9（4）：e94586.

[收稿日期：2014-05-05]endprint

【摘要】 目的 研究環氧化酶-2在鼻咽癌中的表達， 探討其與鼻咽癌的增生、浸潤及轉移的關系。方法 在26例鼻咽癌及相應癌旁組織和10例正常鼻咽部黏膜組織中， 應用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法檢測環氧化酶-2 mRNA的表達。結果 在鼻咽癌組織中環氧化酶-2 mRNA高表達， 在正常鼻咽部黏膜環氧化酶-2 mRNA中低表達， 差異具有統計學意義（P<0.01）。結論 環氧化酶-2與鼻咽癌的生長、浸潤及轉移有密切關系。

【關鍵詞】 鼻咽癌；環氧化酶-2；逆轉錄-聚合酶鏈反應

環氧化酶-2（cyclooxygenase-2， COX-2）是前列腺素（PGs）合成過程中主要限速酶， 不僅在炎癥等過程中發揮重要作用， 而且還與腫瘤的增生、浸潤和轉移密切相關[1]。鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma， NPC）是具有極高的浸潤和轉移能力的腫瘤本實驗通過RT-PCR方法研究在鼻咽癌中COX-2的表達， 探討COX-2在鼻咽癌的增生、浸潤及轉移中的作用。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 鼻咽癌及相應癌旁組織26例， 來源于本院鼻咽部活檢標本， 其中有淋巴結轉移病例19例、無淋巴結轉移病例7例。癌旁組織取自腫瘤邊緣5 mm以外區域， 10例正常鼻咽部黏膜組織取于鼻咽部正常的手術患者。病理學診斷均為鱗狀細胞癌， 其中高分化3例、中分化4例、低分化19例。其中男19例， 女7例， 年齡最小27歲， 最大78歲， 平均年齡（48.026±5.517）歲， 術前均未經化療或放療。

1. 2 主要試劑與儀器 逆轉錄酶MLV（MBI）， TRIzol試劑（GibCO）， dNTP（MBI）， TaqDNA聚合酶（MBI）， GDS8000型凝膠成像系統（UVP）， PTC-200 PCR儀（MJA）， Grab-it 4.0分析軟件為Gelworks 1D interdiate， DU650型紫外光分光光度儀（BECKMAN）。

1. 3 引物設計 泳道M：Marker；泳道1～2分別是COX-2 mRNA在無淋巴結轉移的鼻咽癌組織和有淋巴結轉移鼻咽癌組織中的PCR產物（236 bp）；泳道3～4分別是COX-2 mRNA在癌旁組織和正常鼻咽部黏膜中的PCR產物（236 bp）。

1. 4 組織RNA提取和cDNA合成 取約50 mg組織放入勻漿器中， 勻漿加入1 ml TRIzol， 用氯仿和異丙醇逐步提取RNA， 溶于焦碳酸二乙脂水中， 然后應用紫外分光光度儀檢測定量。

1. 5 RT-PCR反應 以cDNA為模板， 擴增COX-2 （236 bp）及β-actin （300 bp）等基因片斷。

PCR反應體系為25 μl， 含上述基因cDNA 2.0 μl， dNTP 的終濃度0.2 mmol/L， 10×Buffer 2.5 μl， Mg2+的終濃度2.0 mmol/L， TaqDNA聚合酶1 U， 上游和下游引物的終濃度各0.2 μmol/L。β-actin為內參照物。

PCR反應條件為95℃預變性5 min， 95℃ 1 min、50℃ 1 min、72℃ 1 min， 然后72℃延伸5 min。反應結束后取5 μl產物電泳， 用grab-It成像系統照像， 然后分析各條帶的積分吸光密度值， 以目的基因與β-actin的相對積分吸光密度值記錄結果。

1. 6 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件對數據進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2. 2 在鼻咽癌癌旁組織和正常鼻咽部黏膜中COX-2 mRNA低表達， 見圖1， 相對平均吸光度值分別為：（0.2069±0.0372）、（0.2183±0.0417）。二值差異無統計學意義（t=1.358， P>0.05）。

2. 3 在鼻咽癌組織中COX-2 mRNA的表達與在正常鼻咽部黏膜COX-2 mRNA的表達之間， 差異均具有統計學意義（P<0.01）。

3 討論

鼻咽癌為我國最常見的惡性腫瘤之一， 是極易轉移的腫瘤， 通常頸淋巴結轉移常為患者最早發現的體征， 頸部腫塊為此病首發者約占60%。COX-2在正常組織中不表達或微量表達， 而在病理情況下， COX-2在炎癥、腫瘤等組織中表達增高， COX-2的高表達與多種腫瘤的發生發展關系密切[1]。本實驗檢測表明， COX-2在鼻咽癌組織中均高表達， 在癌旁組織和正常鼻咽部黏膜中低表達。本實驗結果表明， 鼻咽癌的增長、浸潤及轉移與COX-2的高表達有密切的關系。

3. 1 COX-2促進腫瘤新生血管的形成血管內皮生長因子（VEGF）是促進腫瘤新生血管生成的作用最強的因子之一。在腫瘤中高表達的COX-2可促使VEGF生成增加， COX-2與VEGF協同作用， 促進腫瘤新生血管的生成[2]。文獻報道， 在鼻咽癌中VEGF高表達， 鼻咽癌的失控增殖能力與VEGF的高表達有密切關系。結合本實驗結果， 在鼻咽癌組織中COX-2高表達， 表明COX-2與VEGF共同促進鼻咽癌新生血管的生成。

3. 2 COX-2促進腫瘤細胞的增殖 在腫瘤中COX-2高表達， 促進腫瘤合成大量PGs， 進而促進腫瘤細胞增殖[3]。結合本實驗結果， COX-2在鼻咽癌組織中均高表達， 表明COX-2促進了鼻咽癌細胞的增殖。

3. 3 COX-2促進腫瘤的浸潤和轉移 研究表明， 在腫瘤組織中COX-2表達增高， 同時有基質金屬蛋白酶-2和基質金屬蛋白酶-9的表達升高， E-鈣粘連素的表達降低， 共同促進了腫瘤細胞的浸潤和轉移。鼻咽癌是具有極高浸潤和轉移能力的腫瘤， 本實驗結果顯示， COX-2在鼻咽癌組織中均高表達， 表明COX-2促進了鼻咽癌細胞的浸潤和轉移。

綜上所述， 鼻咽癌中COX-2表達升高， 說明了鼻咽癌細胞的增生、浸潤及轉移與COX-2的高表達有密切關系。因此， COX-2成為了研究和治療腫瘤的重要靶分子之一， 在抗腫瘤的研究治療中有重要的意義。

參考文獻

[1] Fukazawa EM， Baiocchi G， Soares FA， et al. Cox-2， EGFR， and ERBB-2 Expression in Cervical Intraepithelial Neoplasia and Cervical Cancer Using an Automated Imaging System. Int J Gynecol Pathol， 2014， 33（3）：225-234.

[2] Nagoya H， Futagami S， Shimpuku M， et al. Apurinic/apyrimidinic endonuclease-1 is associated with angiogenesis and VEGF production via upregulation of COX-2 expression in esophageal cancer tissues. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol， 2014， 306（3）：183-190.

[3] Zhao H， Luo F， Li H， et al. Antinociceptive Effect of Tetrandrine on LPS-Induced Hyperalgesia via the Inhibition of IKKβ Phosphorylation and the COX-2/PGE2 Pathway in Mice. PLoS One， 2014， 9（4）：e94586.

[收稿日期：2014-05-05]endprint

【摘要】 目的 研究環氧化酶-2在鼻咽癌中的表達， 探討其與鼻咽癌的增生、浸潤及轉移的關系。方法 在26例鼻咽癌及相應癌旁組織和10例正常鼻咽部黏膜組織中， 應用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法檢測環氧化酶-2 mRNA的表達。結果 在鼻咽癌組織中環氧化酶-2 mRNA高表達， 在正常鼻咽部黏膜環氧化酶-2 mRNA中低表達， 差異具有統計學意義（P<0.01）。結論 環氧化酶-2與鼻咽癌的生長、浸潤及轉移有密切關系。

【關鍵詞】 鼻咽癌；環氧化酶-2；逆轉錄-聚合酶鏈反應

環氧化酶-2（cyclooxygenase-2， COX-2）是前列腺素（PGs）合成過程中主要限速酶， 不僅在炎癥等過程中發揮重要作用， 而且還與腫瘤的增生、浸潤和轉移密切相關[1]。鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma， NPC）是具有極高的浸潤和轉移能力的腫瘤本實驗通過RT-PCR方法研究在鼻咽癌中COX-2的表達， 探討COX-2在鼻咽癌的增生、浸潤及轉移中的作用。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 鼻咽癌及相應癌旁組織26例， 來源于本院鼻咽部活檢標本， 其中有淋巴結轉移病例19例、無淋巴結轉移病例7例。癌旁組織取自腫瘤邊緣5 mm以外區域， 10例正常鼻咽部黏膜組織取于鼻咽部正常的手術患者。病理學診斷均為鱗狀細胞癌， 其中高分化3例、中分化4例、低分化19例。其中男19例， 女7例， 年齡最小27歲， 最大78歲， 平均年齡（48.026±5.517）歲， 術前均未經化療或放療。

1. 2 主要試劑與儀器 逆轉錄酶MLV（MBI）， TRIzol試劑（GibCO）， dNTP（MBI）， TaqDNA聚合酶（MBI）， GDS8000型凝膠成像系統（UVP）， PTC-200 PCR儀（MJA）， Grab-it 4.0分析軟件為Gelworks 1D interdiate， DU650型紫外光分光光度儀（BECKMAN）。

1. 3 引物設計 泳道M：Marker；泳道1～2分別是COX-2 mRNA在無淋巴結轉移的鼻咽癌組織和有淋巴結轉移鼻咽癌組織中的PCR產物（236 bp）；泳道3～4分別是COX-2 mRNA在癌旁組織和正常鼻咽部黏膜中的PCR產物（236 bp）。

1. 4 組織RNA提取和cDNA合成 取約50 mg組織放入勻漿器中， 勻漿加入1 ml TRIzol， 用氯仿和異丙醇逐步提取RNA， 溶于焦碳酸二乙脂水中， 然后應用紫外分光光度儀檢測定量。

1. 5 RT-PCR反應 以cDNA為模板， 擴增COX-2 （236 bp）及β-actin （300 bp）等基因片斷。

PCR反應體系為25 μl， 含上述基因cDNA 2.0 μl， dNTP 的終濃度0.2 mmol/L， 10×Buffer 2.5 μl， Mg2+的終濃度2.0 mmol/L， TaqDNA聚合酶1 U， 上游和下游引物的終濃度各0.2 μmol/L。β-actin為內參照物。

PCR反應條件為95℃預變性5 min， 95℃ 1 min、50℃ 1 min、72℃ 1 min， 然后72℃延伸5 min。反應結束后取5 μl產物電泳， 用grab-It成像系統照像， 然后分析各條帶的積分吸光密度值， 以目的基因與β-actin的相對積分吸光密度值記錄結果。

1. 6 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件對數據進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2. 2 在鼻咽癌癌旁組織和正常鼻咽部黏膜中COX-2 mRNA低表達， 見圖1， 相對平均吸光度值分別為：（0.2069±0.0372）、（0.2183±0.0417）。二值差異無統計學意義（t=1.358， P>0.05）。

2. 3 在鼻咽癌組織中COX-2 mRNA的表達與在正常鼻咽部黏膜COX-2 mRNA的表達之間， 差異均具有統計學意義（P<0.01）。

3 討論

鼻咽癌為我國最常見的惡性腫瘤之一， 是極易轉移的腫瘤， 通常頸淋巴結轉移常為患者最早發現的體征， 頸部腫塊為此病首發者約占60%。COX-2在正常組織中不表達或微量表達， 而在病理情況下， COX-2在炎癥、腫瘤等組織中表達增高， COX-2的高表達與多種腫瘤的發生發展關系密切[1]。本實驗檢測表明， COX-2在鼻咽癌組織中均高表達， 在癌旁組織和正常鼻咽部黏膜中低表達。本實驗結果表明， 鼻咽癌的增長、浸潤及轉移與COX-2的高表達有密切的關系。

3. 1 COX-2促進腫瘤新生血管的形成血管內皮生長因子（VEGF）是促進腫瘤新生血管生成的作用最強的因子之一。在腫瘤中高表達的COX-2可促使VEGF生成增加， COX-2與VEGF協同作用， 促進腫瘤新生血管的生成[2]。文獻報道， 在鼻咽癌中VEGF高表達， 鼻咽癌的失控增殖能力與VEGF的高表達有密切關系。結合本實驗結果， 在鼻咽癌組織中COX-2高表達， 表明COX-2與VEGF共同促進鼻咽癌新生血管的生成。

3. 2 COX-2促進腫瘤細胞的增殖 在腫瘤中COX-2高表達， 促進腫瘤合成大量PGs， 進而促進腫瘤細胞增殖[3]。結合本實驗結果， COX-2在鼻咽癌組織中均高表達， 表明COX-2促進了鼻咽癌細胞的增殖。

3. 3 COX-2促進腫瘤的浸潤和轉移 研究表明， 在腫瘤組織中COX-2表達增高， 同時有基質金屬蛋白酶-2和基質金屬蛋白酶-9的表達升高， E-鈣粘連素的表達降低， 共同促進了腫瘤細胞的浸潤和轉移。鼻咽癌是具有極高浸潤和轉移能力的腫瘤， 本實驗結果顯示， COX-2在鼻咽癌組織中均高表達， 表明COX-2促進了鼻咽癌細胞的浸潤和轉移。

綜上所述， 鼻咽癌中COX-2表達升高， 說明了鼻咽癌細胞的增生、浸潤及轉移與COX-2的高表達有密切關系。因此， COX-2成為了研究和治療腫瘤的重要靶分子之一， 在抗腫瘤的研究治療中有重要的意義。

參考文獻

[1] Fukazawa EM， Baiocchi G， Soares FA， et al. Cox-2， EGFR， and ERBB-2 Expression in Cervical Intraepithelial Neoplasia and Cervical Cancer Using an Automated Imaging System. Int J Gynecol Pathol， 2014， 33（3）：225-234.

[2] Nagoya H， Futagami S， Shimpuku M， et al. Apurinic/apyrimidinic endonuclease-1 is associated with angiogenesis and VEGF production via upregulation of COX-2 expression in esophageal cancer tissues. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol， 2014， 306（3）：183-190.

[3] Zhao H， Luo F， Li H， et al. Antinociceptive Effect of Tetrandrine on LPS-Induced Hyperalgesia via the Inhibition of IKKβ Phosphorylation and the COX-2/PGE2 Pathway in Mice. PLoS One， 2014， 9（4）：e94586.

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