血鸚鵡魚腸道潛在益生菌的分離鑒定和培養條件優化

楊寧+姜芳燕+黃海

摘 要 從血鸚鵡魚（Cichlasoma citrinellum×C.synspilum）腸道內分離了7種細菌，經純化培養和感染實驗確定其中1種為潛在益生菌（0129B），該細菌經形態特征、生理生化特征和16S rRNA序列分析，為革蘭氏陽性菌，桿狀，葡萄糖、甘露醇、明膠、硝酸鹽（還原）、甘露糖等5項指標為陽性，麥芽糖、阿拉伯糖、木糖等15項指標為陰性；16S rRNA方法擴增出1 541 bp片段，鑒定其為堅強芽孢桿菌（Bacillus firmus）。通過比較研究不同鹽度、溫度、pH值對該菌生長的影響，初步確定該菌的合適培養條件為鹽度10、溫度40℃、pH值8。

關鍵詞 血鸚鵡 ；益生菌 ；堅強芽孢桿菌；16S rRNA ；培養條件

分類號 S942.42

Isolation and Identification of Potential Probiotic from Intestine of

Cichlasoma citrinellum × C. synspilum and Optimization of Culture Conditions

YANG Ning1） JIANG Fangyan2） HUANG Hai1）

（1 Sanya Sci-Tech Academy of Hainan National Breeding and Multiplication， Sanya， 572000， China

2 School of Biological Science and Technology， Qiongzhou University， Sanya， 572022， China）

Abstract 7 kind of bacteria were isolated from intestine of Cichlasoma citrinellum×C.synspilum， 1 kind of bacteria named 0129B was potential probiotics by purification culture and infection experiments. Morphological characters， physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA sequence were analyzed， gram positive， rod-shaped， 5 indicators were positive including glucose， mannitol， gelatin， nitrate （reduction） and mannose， 15 indicators were negative including maltose， arabinose， xylose， etc. 1541 bp fragment were amplified by 16S rRNA method， 0129B was identified as Bacillus firmus. The effection of salinity， temperature and pH on the growth of 0129B were studied， suitable culture conditions were identified， salinity 10， temperature 40℃， pH 8.

Keywords Cichlasoma citrinellum×C. Synspilum ； probiotic ； Bacillus firmus ； 16S rRNA ； culture conditions

血鸚鵡魚（Cichlasoma citrinellum×C. synspilum）俗稱紅財神，為雄性紅魔鬼（C. citrinellum）和雌性紫紅火口（C. synspilum）的雜交種，成魚體色主要呈紅色，經人工處理還可呈黃色、綠色、橙色等多種顏色，形態有心形、元寶形、獨角形等，是一種深受歡迎的淡水觀賞魚類。海南是我國最大的血鸚鵡魚輸出省份，但在其工廠化養殖過程中病害時有發生，嚴重影響該產業的發展。在提倡生態養殖、健康養殖的今天，益生菌在水產養殖應用中顯示出了重要作用，國內外有大量關于益生菌在魚類、蝦蟹類和貝類養殖中應用的報道，如：曾東[1]從鯉魚（Cyprinus carpio）腸道內分離的3種益生菌具有提高鯉魚免疫機能和消化酶活性，改善其腸道菌群多樣性等作用；Macey等[2]研究表明，益生菌對中間鮑（Haliotis midae）具有促進生長和提高抗病力作用；Iehata等[3]研究表明，益生菌可提高日本大鮑（Haliotis gigantea）的腸道內環境，進而影響腸道菌群分布；劉君等[4]從凡納濱對蝦腸道分離出2種益生菌，拌料投喂可提高蝦體免疫酶活性和抗病毒能力。本研究通過從血鸚鵡魚腸道內分離出細菌，經注射感染試驗找到潛在益生菌，并研究其合適的培養條件，以期為益生菌的篩選和應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用魚

血鸚鵡魚來源于三亞市南繁科學技術研究院觀賞魚重點實驗室，選取無發病史的健康個體，體長（11.72±1.17）cm，體寬（6.10±0.84）cm，體重（32.25±1.50）g。于水族箱內暫養一周后用于試驗。

1.1.2 培養基

益生菌分離和培養所用的培養基配方如下（g/L）：牛肉膏3.0、酵母提取物 1.0 g、胰蛋白胨 5.0、NaCl 5.0、瓊脂15.0。

1.2 方法endprint

1.2.1 腸道細菌的分離

先用75%酒精將血鸚鵡魚體表消毒，剖開腹部及腸道，在無菌條件下，用接種環接種腸道內溶物于固體培養基上，30℃培養24 h，挑取菌落形態特征不同的菌落，純化2次，獲得菌種用15%甘油-80℃冰箱保藏備用。

1.2.2 注射感染試驗

純化后的細菌經擴大培養后配成菌濃度為1×108 CFU/mL，腹腔注射健康血鸚鵡魚，0.2 mL/尾，對照組注射同劑量的生理鹽水，每組20尾，每組設一平行。觀察記錄一周內的成活情況。

1.2.3 潛在益生菌的形態觀察

對上述注射感染試驗中未出現血鸚鵡死亡的細菌進行革蘭氏染色和顯微觀察，記錄該菌的形態特征。

1.2.4 潛在益生菌的生理生化鑒定

生理生化鑒定指標有：葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、木糖、半乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、山梨醇、鼠李糖、西蒙氏枸椽酸鹽、纖維二塘、VP、苯丙氨酸、明膠、硝酸鹽（還原）、蜜二糖、甘露糖、棉子糖、水楊素、尿素共20項。

1.2.5 潛在益生菌的16S rRNA分子生物學鑒定

菌株16S rRNA分析參照文獻[5]的方法。通過常規PCR后，采用2%的瓊脂糖電泳，切膠回收，將目的片段送深圳華大基因有限公司測序。測序結果提交GenBank，獲取登錄號。并與已發表的16S rRNA序列進行比對，采用Mega 5.0軟件構建系統發育樹，確定菌株的分子分類地位。

1.2.6 潛在益生菌的合適培養條件研究

試驗共設鹽度、溫度、pH值等3個因子，溫度分別為20、25、30、35和40℃，鹽度分別為0、5、10、15和20，pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0。考察溫度影響時，鹽度和pH分別是5和7；考察鹽度影響時，溫度和pH分別是30℃和7；考察pH影響時，溫度和鹽度分別是30℃和5，200 r/min振蕩培養24 h后，以平板涂布計數法計算出原菌液濃度，比較不同培養條件對細菌生長的影響。

1.2.7 數據統計與處理

試驗數據采用（平均值±標準差）表示，用SPSS 19進行數據分析，進行單因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 細菌分離和注射感染試驗結果

從腸道分離得到7種細菌，菌落形態特征、所占比例和注射感染的致死率見表1。通過注射感染試驗，只有0129B一種細菌對血鸚鵡的致死率為0%，認為是潛在益生菌，命名為0129B。

2.2 菌株0129B的鑒定

菌株0129B革蘭氏染色結果為陽性，短桿狀，大小為1.2 μm×0.6 μm，常多個菌株鏈狀排列。

生理生化特征分析結果表明（表2），該菌株的葡萄糖、硝酸鹽（還原）、明膠、甘露醇、甘露糖、蔗糖6項指標均為陽性，其余檢測指標呈陰性。根據《伯杰氏手冊》[6]和《常見細菌系統鑒定手冊》[7]等資料，初步鑒定菌株0129B為堅強芽孢桿菌（Bacillus firmus）。

以菌株0129B基因組DNA為模板，采用16S rRNA的通用引物進行PCR擴增，目的片段經測序分析，確定得到的目的片段長為1 451 bp（圖1）。

通過BLAST，將與菌株0129B的16S rRNA同源性較高的同一屬3種細菌和親緣關系較遠的16種細菌選出，用MEGA 5.0軟件對這20種序列進行同源性比對，Neighbor-joining法構建系統發育樹，自舉分析（Bootstrap）1 000次，0129B與堅強芽孢桿菌相似性100%（圖2）。

綜合菌株的形態特征、生理生化特征和16S rRNA分析，確定所分離的潛在益生菌菌株0129B為堅強芽孢桿菌（GenBank登錄號：KC916741）。

2.3 鹽度對菌株0129B生長的影響

研究結果表明（圖3），4種不同鹽度對菌株0129B生長具有顯著影響（P<0.05），其中鹽度為10時，細菌的培養濃度最高，當鹽度降低到5時，菌數大量減少，當鹽度增加到15時，菌數稍有降低，當鹽度增加到20時，菌數大量減少，表明該菌株的合適培養鹽度為10。

2.4 不同溫度下細菌的生長狀況

研究結果表明（圖4），4種不同溫度對菌株0129B生長具有顯著影響（P<0.05），細菌濃度隨溫度的升高而增加，25℃時濃度最低，40℃時達到最高，表明該菌株的合適培養溫度為40℃。

2.5 不同pH值下細菌的生長狀況

培養基的酸堿度對微生物的生長代謝和產酶有很大的影響，pH可以改變細胞膜的通透性、營養物質的溶解性，影響微生物對營養物質的吸收。培養基分別設置5、6、7、8、9五個不同pH值條件進行，各組差異顯著。從圖5可以看出，pH值由5～8細菌數量呈增加趨勢，pH值為8的菌落數量增加最為明顯，當pH值為9時又突然下降。

3 討論與結論

3.1 潛在益生菌的分離和鑒定

本試驗成功從血鸚鵡魚腸道內分離到潛在益生菌菌株，通過細菌形態特征觀察、生理生化和16S rRNA的測定，最終鑒定菌株0129B為堅強芽孢桿菌。有關堅強芽孢桿菌的研究較多，大部分集中在該菌對養殖對象和養殖水體影響。李桂英等[8]研究表明，飼料中添加堅強芽孢桿菌可顯著提高凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）的非特異性免疫水平和抵抗對蝦白斑綜合癥病毒的能力。孫艷[9]研究表明，堅強芽孢桿菌活菌和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）活菌結合使用，可顯著搞高凡納濱對蝦抗對蝦白斑綜合癥病毒感染的能力。柴鵬程等[10]研究表明，用拌有堅強芽孢桿菌的飼料投喂凡納濱對蝦，能顯著提高對蝦的生長率和淋巴器官中STAT基因的表達。郭靜[11]等通過富集培養，從養殖水體中分離到堅強芽孢桿菌，該菌對氨氮和亞硝態氮的降解率分別達80%和90%以上。不過，有關魚源性堅強芽孢桿菌的研究較少，本文從血鸚鵡腸道中分離得到的1株堅強芽孢桿菌，該菌對血鸚鵡無致病性，為下一步開展該菌的活性研究奠定了基礎。endprint

3.2 潛在益生菌株0129B的培養條件優化

本文研究了鹽度、溫度和pH值對菌株0129B生長的影響，確定了該菌的合適培養條件為鹽度10、溫度40℃、pH 8。其中，菌株0129B的合適培養鹽度與李坤等[12]對益生細菌沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudanonas palustris）的研究結果相似；其合適培養溫度與趙先鋒[13]所分離的堅強芽孢桿菌的最適生長溫度（30～40℃）相似，但與鐘碩良等[14]對益生菌哈維氏弧菌（Vibro harveyi）的溫度影響研究結果不同；其合適pH值與沈錦玉[15]對光合細菌類球紅細菌（Rhodobacter sphaeroides）試驗結果相似，但與趙先鋒[12]所分離的堅強芽孢桿菌最適pH 5.4～7.2不同。

通過感染試驗，初步驗證了本試驗分離的堅強芽孢桿菌對水產養殖對象無致病性，并通過對其生長環境條件的研究，初步掌握了該益生菌體外培養中生長變化規律，為大量培養提供了理論依據。本試驗中的菌種僅是潛在益生菌，實際應用中該菌的益生作用，如對宿主的生長、非特異性免疫和水環境的影響還有待進一步研究。

參考文獻

[1] 曾 東. 鯉益生菌的篩選、生物學特性及作用機理的研究[D]. 成都：四川農業大學，2009.

[2] Macey B M， Coyne V E. Improved growth rate and disease resistance in farmed Haliotis midae through probiotic treatment[J]. Aquaculture， 2005， 245： 249-261.

[3] Iehata S， Inagaki T， Okunishi S， et al. Improved gut environment of abalone Haliotis gigantea through Pediococcus sp. Ab1 treatment[J]. Aquaculture， 2010， 305： 59-65.

[4] 劉 君，宋曉玲，劉 莉，等. 2株消化道優勢菌對凡納濱對蝦免疫酶活性和抗白斑綜合征病毒感染力的影響[J]. 水產學報，2012，36（3）：444-450.

[5] 楊 寧，黃 海，張 希，等. 尼羅羅非魚嗜水單胞菌的病原分離鑒定和藥敏試驗[J]. 水產科學，2014，33（5）：306-310.

[6] 布坎南. 伯杰細菌鑒定手冊（第九版）[M]. 中國科學院微生物研究所譯. 北京：科學出版社，1994：745-746.

[7] 東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001：162-171.

[8] 李桂英，寧曉玲，孫 艷，等. 幾株腸道益生菌對凡納濱對蝦非特異性免疫力和抗病力的影響[J]. 中國水產科學，2011，18（6）：1 358-1 367.

[9] 孫 艷. 對蝦抗病微生物的篩選及其作用機制的研究[D]. 青島：中國海洋大學， 2012.

[10] 柴鵬程，宋曉玲. 飼料中添加芽孢桿菌PC465對凡納濱對蝦生長和STAT基因表達的影響[J]. 漁業科學進展， 2013，34（3）：97-103.

[11] 郭 靜，熊 焰，李 華. 養殖水體中水質凈化菌的篩選和鑒定[J]. 水利漁業，2008， 28（4）：105-106.

[12] 李 坤，王福強，張 輝. 環境條件對光合細菌生長的影響[J]. 大連大學學報，2011，32（3）：79-82.

[13] 趙先鋒. 利用農業副產品發酵堅強芽孢桿菌及其用于加強生物絮團培養的研究[D]. 青島：中國海洋大學，2011.

[14] 鐘碩良，陳良忠，周 宸. 環境因子對發光細菌的生長及日本對蝦仔蝦感染死亡率的影響[J]. 中國水產科學，2001，8（1）：41-45.

[15] 沈錦玉，劉 向，尹文林，等. 光合細菌HZPSB菌株的分離鑒定及其生長特性的測定[J]. 科技通報，2005，21（1）： 69-73.endprint

3.2 潛在益生菌株0129B的培養條件優化

本文研究了鹽度、溫度和pH值對菌株0129B生長的影響，確定了該菌的合適培養條件為鹽度10、溫度40℃、pH 8。其中，菌株0129B的合適培養鹽度與李坤等[12]對益生細菌沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudanonas palustris）的研究結果相似；其合適培養溫度與趙先鋒[13]所分離的堅強芽孢桿菌的最適生長溫度（30～40℃）相似，但與鐘碩良等[14]對益生菌哈維氏弧菌（Vibro harveyi）的溫度影響研究結果不同；其合適pH值與沈錦玉[15]對光合細菌類球紅細菌（Rhodobacter sphaeroides）試驗結果相似，但與趙先鋒[12]所分離的堅強芽孢桿菌最適pH 5.4～7.2不同。

通過感染試驗，初步驗證了本試驗分離的堅強芽孢桿菌對水產養殖對象無致病性，并通過對其生長環境條件的研究，初步掌握了該益生菌體外培養中生長變化規律，為大量培養提供了理論依據。本試驗中的菌種僅是潛在益生菌，實際應用中該菌的益生作用，如對宿主的生長、非特異性免疫和水環境的影響還有待進一步研究。

參考文獻

[1] 曾 東. 鯉益生菌的篩選、生物學特性及作用機理的研究[D]. 成都：四川農業大學，2009.

[2] Macey B M， Coyne V E. Improved growth rate and disease resistance in farmed Haliotis midae through probiotic treatment[J]. Aquaculture， 2005， 245： 249-261.

[3] Iehata S， Inagaki T， Okunishi S， et al. Improved gut environment of abalone Haliotis gigantea through Pediococcus sp. Ab1 treatment[J]. Aquaculture， 2010， 305： 59-65.

[4] 劉 君，宋曉玲，劉 莉，等. 2株消化道優勢菌對凡納濱對蝦免疫酶活性和抗白斑綜合征病毒感染力的影響[J]. 水產學報，2012，36（3）：444-450.

[5] 楊 寧，黃 海，張 希，等. 尼羅羅非魚嗜水單胞菌的病原分離鑒定和藥敏試驗[J]. 水產科學，2014，33（5）：306-310.

[6] 布坎南. 伯杰細菌鑒定手冊（第九版）[M]. 中國科學院微生物研究所譯. 北京：科學出版社，1994：745-746.

[7] 東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001：162-171.

[8] 李桂英，寧曉玲，孫 艷，等. 幾株腸道益生菌對凡納濱對蝦非特異性免疫力和抗病力的影響[J]. 中國水產科學，2011，18（6）：1 358-1 367.

[9] 孫 艷. 對蝦抗病微生物的篩選及其作用機制的研究[D]. 青島：中國海洋大學， 2012.

[10] 柴鵬程，宋曉玲. 飼料中添加芽孢桿菌PC465對凡納濱對蝦生長和STAT基因表達的影響[J]. 漁業科學進展， 2013，34（3）：97-103.

[11] 郭 靜，熊 焰，李 華. 養殖水體中水質凈化菌的篩選和鑒定[J]. 水利漁業，2008， 28（4）：105-106.

[12] 李 坤，王福強，張 輝. 環境條件對光合細菌生長的影響[J]. 大連大學學報，2011，32（3）：79-82.

[13] 趙先鋒. 利用農業副產品發酵堅強芽孢桿菌及其用于加強生物絮團培養的研究[D]. 青島：中國海洋大學，2011.

[14] 鐘碩良，陳良忠，周 宸. 環境因子對發光細菌的生長及日本對蝦仔蝦感染死亡率的影響[J]. 中國水產科學，2001，8（1）：41-45.

[15] 沈錦玉，劉 向，尹文林，等. 光合細菌HZPSB菌株的分離鑒定及其生長特性的測定[J]. 科技通報，2005，21（1）： 69-73.endprint

3.2 潛在益生菌株0129B的培養條件優化

本文研究了鹽度、溫度和pH值對菌株0129B生長的影響，確定了該菌的合適培養條件為鹽度10、溫度40℃、pH 8。其中，菌株0129B的合適培養鹽度與李坤等[12]對益生細菌沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudanonas palustris）的研究結果相似；其合適培養溫度與趙先鋒[13]所分離的堅強芽孢桿菌的最適生長溫度（30～40℃）相似，但與鐘碩良等[14]對益生菌哈維氏弧菌（Vibro harveyi）的溫度影響研究結果不同；其合適pH值與沈錦玉[15]對光合細菌類球紅細菌（Rhodobacter sphaeroides）試驗結果相似，但與趙先鋒[12]所分離的堅強芽孢桿菌最適pH 5.4～7.2不同。

通過感染試驗，初步驗證了本試驗分離的堅強芽孢桿菌對水產養殖對象無致病性，并通過對其生長環境條件的研究，初步掌握了該益生菌體外培養中生長變化規律，為大量培養提供了理論依據。本試驗中的菌種僅是潛在益生菌，實際應用中該菌的益生作用，如對宿主的生長、非特異性免疫和水環境的影響還有待進一步研究。

參考文獻

[1] 曾 東. 鯉益生菌的篩選、生物學特性及作用機理的研究[D]. 成都：四川農業大學，2009.

[2] Macey B M， Coyne V E. Improved growth rate and disease resistance in farmed Haliotis midae through probiotic treatment[J]. Aquaculture， 2005， 245： 249-261.

[3] Iehata S， Inagaki T， Okunishi S， et al. Improved gut environment of abalone Haliotis gigantea through Pediococcus sp. Ab1 treatment[J]. Aquaculture， 2010， 305： 59-65.

[4] 劉 君，宋曉玲，劉 莉，等. 2株消化道優勢菌對凡納濱對蝦免疫酶活性和抗白斑綜合征病毒感染力的影響[J]. 水產學報，2012，36（3）：444-450.

[5] 楊 寧，黃 海，張 希，等. 尼羅羅非魚嗜水單胞菌的病原分離鑒定和藥敏試驗[J]. 水產科學，2014，33（5）：306-310.

[6] 布坎南. 伯杰細菌鑒定手冊（第九版）[M]. 中國科學院微生物研究所譯. 北京：科學出版社，1994：745-746.

[7] 東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001：162-171.

[8] 李桂英，寧曉玲，孫 艷，等. 幾株腸道益生菌對凡納濱對蝦非特異性免疫力和抗病力的影響[J]. 中國水產科學，2011，18（6）：1 358-1 367.

[9] 孫 艷. 對蝦抗病微生物的篩選及其作用機制的研究[D]. 青島：中國海洋大學， 2012.

[10] 柴鵬程，宋曉玲. 飼料中添加芽孢桿菌PC465對凡納濱對蝦生長和STAT基因表達的影響[J]. 漁業科學進展， 2013，34（3）：97-103.

[11] 郭 靜，熊 焰，李 華. 養殖水體中水質凈化菌的篩選和鑒定[J]. 水利漁業，2008， 28（4）：105-106.

[12] 李 坤，王福強，張 輝. 環境條件對光合細菌生長的影響[J]. 大連大學學報，2011，32（3）：79-82.

[13] 趙先鋒. 利用農業副產品發酵堅強芽孢桿菌及其用于加強生物絮團培養的研究[D]. 青島：中國海洋大學，2011.

[14] 鐘碩良，陳良忠，周 宸. 環境因子對發光細菌的生長及日本對蝦仔蝦感染死亡率的影響[J]. 中國水產科學，2001，8（1）：41-45.

[15] 沈錦玉，劉 向，尹文林，等. 光合細菌HZPSB菌株的分離鑒定及其生長特性的測定[J]. 科技通報，2005，21（1）： 69-73.endprint