AuroraA、CyclinD1、CyclinB1和Bcl－2在膀胱移行細胞癌的表達及相關性研究

肖 寧，周 興，趙曉昆，蔣宏毅，趙洪青

（1.廣州醫科大學附屬第二醫院泌尿外科，廣東廣州510260；2.中南大學湘雅二醫院泌尿外科，湖南長沙410011）

Aurora激酶家族分為AuroraA、AuroraB和AuroraC 3種，他們參與多種生物學進程，而且在多種實體瘤中有過表達［1］。AuroraA作為中心體相關激酶，當其過表達時可致中心體擴增、染色體不穩定和細胞惡性轉化［2］。因此，AuroraA的異常可能與惡性腫瘤的病理特點、臨床分期及預后有一定相關性，但是不同腫瘤其表現也不一致［3］。為了明確AuroraA在膀胱移行細胞癌（BTCC）發生及進展中的具體機制。本研究通過檢測AuroraA、CyclinD1、CyclinB1和Bcl－2在正常膀胱組織及BTCC組織的表達情況，探討AuroraA在胃癌發生過程中的作用機制，以及與BTCC生物學行為的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料 標本來源：所有標本來自2008年5月至2009年10月手術切除并經病理證實的56例BTCC患者（膀胱根治性切除術30例，膀胱部分切除術6例，經尿道膀胱腫瘤電切術20例）的新鮮組織標本。選擇正常膀胱組織15例（取自開放前列腺手術10例，膀胱憩室切除術3例，膀胱外傷破裂修補術2例）作為對照。所有BTCC患者術前均未行任何放化療，其中，男36例，女20例，年齡29～88歲，平均（58.9±13.9）歲。癌組織取腫塊非壞死部分，按照WHO病理分級：Ⅰ級18例，Ⅱ級22例，Ⅲ級16例；TNM臨床分期診斷標準：淺表性BTCC（Ta～T1期）24例，浸潤性癌（T2～T4期）32例；單發29例，多發27例；初發36例，復發20例。

1.2 主要試劑 PBS、檸檬酸鹽緩沖液CB、一步法免疫組織化學試劑盒購置邁新生物公司，兔抗AuroraA抗體購自Abcam公司，鼠抗CyclinB1抗體購自Santa公司，兔抗CyclinD1抗體和鼠Bcl－2抗體均購自Thermo公司。

1.3 方法 采用SP免疫組織化學法。所有新鮮標本經－196℃液氮罐取回，置于－70℃冰箱保存備用。標本經4%多聚甲醛過夜固定后，浸泡，脫水，石蠟包埋，鑄塊制成5μm切片，分別作蘇木精－伊紅（HE）染色和免疫組織化學染色，其中，HE染色復述組織病理學特征。石臘切片常規脫蠟，水化，進行微波抗原修復，繼以免疫組織化學試劑盒進行檢測。操作步驟按說明書進行。以陽性片及PBS代替一抗設陽性及陰性對照。

圖1 AuroraA、CyclinD1、CyclinB1、Bcl－2在BTCC組織中的陽性表達（免疫組織化學×400）

1.4 統計學處理 采用SPSS16.0軟件進行數據處理。計數資料以率表示，采用χ2檢驗，用Spearman相關分析AuroraA與CyclinD1、CyclinB1、Bcl－2在BTCC中表達的相關性，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 AuroraA、CyclinD1、CyclinB1及Bcl－2蛋白在BTCC組織中的表達 AuroraA染色以胞膜為主，少數胞漿染色，CyclinD1，CyclinB1以胞核為主，少數胞漿染色，Bcl－2為胞漿染色。選取5個具有代表性的視野，共計數1 000個腫瘤細胞，計算腫瘤細胞的陽性率＝（陽性腫瘤細胞數／1 000）×100%。結果判斷：陽性細胞數小于10%為陰性，大于或等于10%陽性。陽性為黃色或棕黃色染色，見圖1。AuroraA、CyclinD1、CyclinB1及Bcl－2蛋白在BTCC的表達陽性率均高于正常膀胱組織的，差異有統計學意義（P＜0.01），見表1。

表1 BTCC和正常膀胱組織中AuroraA、CyclinD1、CyclinB1和Bcl－2蛋白的陽性結果

2.2 AuroraA、CyclinD1、CyclinB1及Bcl－2蛋白在不同病理分級和臨床分期BTCC中的表達 在BTCC組織中AuroraA，CyclinB1和Bcl－2陽性率隨著BTCC的病理分級增高而增加，呈正相關，CyclinD1隨病理分級增加而陽性率下降，組間差異有統計學意義（P＜0.05）。AuroraA陽性率與臨床分期呈正相關，CyclinD1呈負相關，組間差異有統計學意義（P＜0.05）；CyclinB1和Bcl－2陽性率隨著臨床分期增高而增加，但組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 AuroraA、CyclinD1、CyclinB1及Bcl－2與BTCC病理分級和臨床分期的關系

表3 AuroraA蛋白與CyclinD1、CyclinB1及Bcl－2蛋白在BTCC表達的相關性（n）

2.3 BTCC中AuroraA蛋白與CyclinD1、CyclinB1及Bcl－2蛋白表達的相關性 AuroraA與CyclinD1在BTCC組織的陽性率表達呈負相關（r＝－0.535，P＜0.01），AuroraA與CyclinB1陽性率呈正相關（r＝0.594，P＜0.01），AuroraA與Bcl－2陽性率呈正相關（r＝0.508，P＜0.01），見表3。

3 討 論

研究發現Aurora激酶的失常表達與腫瘤發生發展有關，特別是AuroraA過度表達可以引起中心體擴增、染色體不穩定和非整倍體形成而導致腫瘤發生［4］。正常人體組織中，AuroraA只在少數細胞增生活躍的器官中高表達，比如睪丸、胸腺和胎兒肝臟，但是AuroraA在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌等腫瘤中高表達［5］。本研究發現AuroraA在56例BTCC有51.8%（29／56）的陽性表達率，而正常膀胱組織只有13.3%（2／15）的陽性表達率。Sen等［6］發現76.9%的浸潤性或高病理等級膀胱癌AuroraA高表達，而只有7.5%淺表膀胱癌AuroraA高表達，而且高表達AuroraA的腫瘤有轉移和進展傾向并降低患者生存率。與以上實驗結果相似，本研究發現低病理等級（Ⅰ級）BTCC（18例）中 AuroraA陽性率較低（22.2%，4／18），且陽性率與BTCC病理等級呈正相關；AuroraA陽性率與臨床分期有關，T2～T4期BTCC中陽性率較T～T1高。與此相似，Mhawech－Fauceglia等［7］也發現 T1期膀胱癌 AuroraA陽性率較Ta期明顯增加，提示AuroraA是Ta和T1期膀胱癌進展和惡化中的一個重要因子。本實驗通過免疫組織化學證實了AuroraA在BTCC高表達，而且進一步發現AuroraA表達水平與病理分級和臨床分期呈正相關，提示AuroraA在BTCC的發生發展過程中發揮重要作用。

細胞增殖受Cyclins調節，Cyclin高表達可使細胞增殖加快，而且Cyclin還參與DNA的修復、細胞分化和凋亡，其任何環節發生錯誤均可致腫瘤發生。CyclinD1是G1期細胞周期蛋白，驅動細胞從G1期進入S期，促進細胞增殖，是細胞周期重要的正調控因子，在腫瘤發生發展中起著重要作用［8］。本實驗發現CyclinD1陽性率與BTCC病理分級和臨床分期呈負相關，在Ⅰ級為66.7%，Ⅱ級為50.0%，Ⅲ級為18.8%，在Ta～T1為66.7%，T2～T4為31.3%；表明CyclinD1蛋白可能在以細胞增殖為主的腫瘤始發階段發揮作用，而可能不參與腫瘤的浸潤和發展。CyclinB1作為G2期周期蛋白，在許多腫瘤中異常表達（如過表達、定位改變等），呈現出癌基因的特性，CyclinB1過表達與腫瘤惡性表型有關，可以作為腫瘤惡性潛能的指標，而且其表達下調時腫瘤被抑制［9］。本研究發現CyclinB1在56例BTCC中陽性率為75.0%（42／56），且陽性率與病理分級呈正相關：Ⅰ級（50.0%），Ⅱ級（81.8%），Ⅲ級（93.8%），但Ta～T1期陽性率（62.5%）與T2～T4期（84.4%）相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究提示CyclinB1可能參與了BTCC發生和分化過程，因此，檢測CyclinB1對研究BTCC的生物學行為可能具有重要意義。Bcl－2是一種原癌基因，具有阻斷程序化細胞死亡的作用［10］。Bcl－2蛋白異常表達與包括膀胱癌在內的人類多種惡性腫瘤的關系密切［11］。本實驗發現Bcl－2蛋白陽性率為62.5%，陽性率與病理分級呈正相關，但也與臨床分期無關。

CyclinD1和CyclinB1過表達可使細胞持續增殖，并可能導致惡性轉化，而Bcl－2過表達則抑制細胞凋亡。AuroraA參與調節細胞的有絲分裂過程，中止錯誤的細胞周期進程并完成修復過程，可能與細胞的增殖和凋亡有關［2］。AuroraA可能參與對CyclinD1、CyclinB1和Bcl－2的調控，但機制尚不明確。本研究分析發現AuroraA在BTCC陽性率分別與CyclinB1（r＝0.594，P＜0.01）、Bcl－2（r＝0.508，P＜0.01）的陽性率呈明顯的正相關，而與CyclinD1陽性率呈明顯的負相關（r＝－0.535，P＜0.01）。AuroraA－h－CPEB通路可能會引起CyclinB1和CDKs的過度表達［12］。CyclinB1／CDC2復合物的高活性伴有CyclinD1的過度表達［13］。不同腫瘤AuroraA和AuroraB表達明顯增高，二者表達水平同步［14］；AuroraB過度表達會使Survivin蛋白的表達水平升高［15］；Bcl－2作用于半胱氨酸蛋白酶caspase級聯反應上游；而Survivin直接作用于細胞凋亡途徑中的終末效應酶caspase－3、caspase－7［16］。因此，推測BTCC可能通過AuroraA途徑引起CyclinB1高表達，AuroraA和Bcl－2可能有共同的轉錄激活機制，協同發揮促進增殖和抗凋亡作用；Aurora家族對G1／S和G2／M均有調控作用，對于G1期的CyclinD1應該有相互調控關系。雖然AuroraA陽性率與CyclinD1陽性率呈明顯的負相關，但是兩者在BTCC均高表達，統計學差異可能來源于不同病理分級的標本數目。

AuroraA、CyclinD1、CyclinB1和Bcl－2與BTCC的發生、進展及其惡性特征密切相關，并且發現AuroraA可能與CyclinD1、CyclinB1和Bcl－2蛋白的表達有關，但還需進一步通過如基因干擾等技術證實他們的相互作用關系。

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