金葡菌法制備Wistar大鼠脛骨骨髓炎骨缺損模型

劉玉新　張麗艷　滕學仁　欒艦

【摘要】 目的：研究將蘸有金黃色葡萄球菌懸液的棉條植入Wistar大鼠脛骨骨缺損中制備骨髓炎骨缺損標本的方法。方法：將健康雄性Wistar大鼠30只按隨機數字表法分為三組，每組10只20個后腿標本。第1組：在Wistar大鼠雙側脛骨近端制造骨缺損；第2組：將蘸有金黃色葡萄球菌懸液的棉條置入骨缺損中；第3組：應用抗生素治療將蘸有金黃色葡萄球菌懸液的棉條置入骨缺損中的大鼠。比較各組大鼠創口愈合時間，并在7、14 d時觀察大鼠體重、體溫、傷口愈合、白細胞計數、脛骨標本及CR并進行比較。結果：三組在體重、體溫、傷口愈合情況、白細胞計數、脛骨標本及CR表現積分上比較差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：在脛骨骨缺損中植入蘸有金黃色葡萄球菌懸液的棉條是制備Wistar大鼠脛骨骨髓炎骨缺損的良好方法。

【關鍵詞】 大鼠； 骨髓炎； 骨缺損

骨髓炎（Osteomyelitic bone defect，OBD）是一個由于微生物感染導致骨骼破壞的炎癥反應過程。其治療對于醫護工作人員來說也是非常棘手的，尤其慢性骨髓炎骨缺損，纏綿難愈，反復發作[1-5]。臨床上對OBD治療的研究很多，關于實驗動物模型量也很多，也發表了很多骨髓炎標本制備的文章，然而未發現有標準的Wistar大鼠骨髓炎骨缺損模型的制備流程[6-10]。基于此，筆者本文介紹了一種制造Wistar大鼠骨髓炎骨缺損模型的簡單實用的新方法。

1 材料與方法

1.1 試劑及動物 金黃色葡萄球菌懸液：標準菌株（ATCC25923），濃度：3×106 CFU；氯胺酮：0.1 g/2 mL；甲醛溶液：10%中性；Wistar健康雄性大鼠30只，開始實驗時6周齡，190～210 g，平均201 g。

1.2 方法 30只大鼠隨機分為三組，每組10只取雙側脛骨近端標本共20個。將每只大鼠稱重，腹部皮下注射氯胺酮（150 mg/kg）麻醉，以8% Na2S脫毛，生理鹽水沖洗干凈后，將大鼠仰臥位固定在手術臺上，碘伏消毒術區皮膚，鋪無菌洞巾，在膝關節下沿脛骨前脊內側切開長約1.5 cm皮膚切口，在脛骨前肌內側進入達骨膜，顯露脛骨上端的前內側面，在膝關節間隙下方1.5～2 mm向下以尖刀片切取骨前內側面骨皮質，將該骨皮質片取出，造成成骨缺損。筆者所切取的皮質骨片和脛骨近端內側面形狀相關，皮質骨片的縱徑為該骨片中點橫徑的2倍，長度：7.0～8.5 mm，平均7.6 mm，骨片橫徑為該處脛骨前內側面骨質橫徑的0.8倍，長度：3.5～4.3 mm，平均3.8 mm。取下皮質骨片后，第1組：殘腔不做處理，分兩層縫合；第2、3組：將蘸有0.3 mL 3×106CFU的金葡菌棉條植入殘腔內，并注射5%魚肝油酸鈉后，骨蠟封閉殘腔，創口分兩層縫合，不包扎。術后第7天時，觀察第1、2組的各項指標。第3組，7 d后開始肌注用頭孢呋辛100 mg/（kg·d），術后第14天時，觀察該組的各項指標及第1組的體重指標。

1.3 觀察指標 （1）體重：術后第7、14天時觀察三組的體重情況；（2）肛溫：實驗時，當天上午9點麻醉后，測量肛溫；（3）白細胞計數（WBC）：斷尾法取血；（4）肉眼觀察脛骨標本：按照Rissing[11]評分標準進行打分評定；（5）CR檢查：術后7 d，按照Smeltzer等[12]人制定的Smeltzer評分系統進行評定分，總分為20分。

1.4 統計學處理 采用 SPSS 19.0統計學軟件進行處理，計量資料以（x±s）表示，比較采用單因素方差分析法及t檢驗，計數資料比較采用 字2檢驗，以P<0.05表示差異與統計學意義。

2 結果

2.1 三組傷口愈合情況比較 傷口按照甲、乙、丙愈合標準評定，三組比較差異有統計學意義（P<0.05），且第1組甲級愈合與第2、3組比較差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 三組創口愈合情況比較 個

組別 甲級愈合 乙級愈合 丙級愈合

第1組（n=20） 20* 0 0

第2組（n=20） 0 5 15

第3組（n=20） 0 11 9

*與第2、3組比較，P<0.05

2.2 三組體重比較 麻醉后，大鼠采用電光分析天平稱重，7 d時，第1組的體重與第2組比較差異有統計學意義（P<0.05）；14 d時，第1組的體重與第3組比較差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

表2 三組體重比較（x±s） g

組別 7 d 14 d

第1組（n=10） 210.6±10.8* 232.4±16.5△

第2組（n=10） 193.3±12.6 -

第3組（n=10） - 218.7±14.6

*與第2組比較，P<0.05；△與第3組比較，P<0.05

2.3 三組其他指標的比較 三組的肛溫、WBC計數、Rissing評分、Smeltzer評分比較差異均有統計學意義（P<0.05），見表3。肉眼觀察脛骨標本情況：第1組無死骨及感染性炎癥反應；第2組骨髓炎急性期（圖1、2）；第3組形成骨髓炎骨缺損模型（圖3、4）。

圖1 骨髓炎急性期膿腔形成

圖2 骨髓炎急性期

3 討論

目前，骨髓炎生物學模型的制作有Stefan法、Fitzgeraid法和Norden法等[13-15]。Stefan法是在Wister大白鼠股靜脈內注入金黃色葡萄球菌液制作動物脛骨骨髓炎模型，但是，該實驗操作困難，效果不確切，成功率低。Fitzgeraid法是以兔脛骨為標本，用金黃色葡萄球菌加骨水泥填入骨缺損，該法由于填充了骨水泥，不利于進一步的手術操作處理。Norden法和Fitzgeraid法類似，筆者在其基礎上加以改進，在Wistar大鼠脛骨上段制造的骨缺損腔內植入蘸有0.3 mL 3×106CFU金黃色葡萄球菌液的紗布，并腔內注射5%魚肝油酸鈉后，以骨蠟封閉骨缺損口，成功制造出模型。術后7 d時，脛骨標本顯示：第1組無死骨及感染性炎癥反應，BD清晰存在，殘腔內填充肉芽組織，邊緣骨膜收縮，髓腔未閉；CR未見死骨形成。第2組創口未愈合，局部發紅、腫脹，可觸及波動感，或者竇道形成，創口內有黃色黏稠膿液流出，骨缺損局部有骨膜反應，殘留死腔；CR表現為脛骨上段出現軟組織腫脹陰影，膿腔形成（圖1）；脛骨局部有矩形缺損區，邊緣有骨溶解破壞，骨小梁排列紊亂，周圍局限性骨質疏松，邊緣骨密度增高。骨膜反應、毛糙及不同程度增厚，為骨髓炎急性期（圖2）。第3組各種癥狀較急性期有所減輕，脛骨上段局部可見竇道、肉芽及瘢痕組織生成，有較稀薄膿液性滲出，殘腔周圍髓腔封閉；CR見脛骨上端軟組織腫脹陰影減小，骨矩形缺損區邊緣骨硬化，周圍骨質疏松，骨小梁排列紊亂，骨質溶解破壞，骨膜反應較急性期減輕，形成OBD模型（圖3、4）。

綜上所述，該法操作容易掌握，效果明確，為制造Wistar大鼠脛骨骨髓炎骨缺損模型的良好方法。

參考文獻

[1]劉玉新，馮秀利，鄒林，等.帶血管局部肌瓣轉移治療股骨骨折術后慢性骨髓炎[J].中華顯微外科，2008，30（31）：138-140.

[2]劉勇.中西醫結合治療創傷性骨髓炎的臨床分析[J].中外醫學研究，2012，10（28）：131-132.

[3]譚美蘭.心理護理干預對骨髓炎手術患者身體恢復的影響探究[J].中國醫學創新，2012，9（27）：54-55.

[4]羅德軍，趙宏斌，周旭，等.脈沖沖洗加負壓封閉引流及開放植骨治療慢性骨髓炎[J].中國骨傷，2010，17（23）：631-633.

[5]劉成龍，郭亭，高杰，等.糖尿病并發慢性骨髓炎的臨床治療方法探討[J].中國骨傷，2013，26（2）：165-167.

[6]翟建國，周碩霞，叢海渡，等.游離皮瓣移植結合骨段滑移技術治療脛骨骨髓炎骨缺損[J].中華顯微外科雜志，2012，8（35）：327-329.

[7]劉立峰，鄒林，曹學成，等.脛骨慢性骨髓炎的顯微外科治療[J].中華顯微外科雜志，2012，33（5）：419-421.

[8]嚴智文，董河，馮偉，等.改良血管阻塞方法建立大鼠全腦缺血模型[J].中國醫學創新，2013，10（1）：1-3.

[9]臧福才，唐偉，白鷹.丁苯酞對大鼠腦缺血再灌注損傷神經保護作用的研究[J].中國醫學創新，2013，10（9）：15-16.

[10]顧文浩，胡嵐祥，徐祝軍，等.環扎大鼠脊髓損傷早期不同時機減壓后光密度測量熱休克蛋白70的表達及其與神經細胞凋亡的相關性研究[J].中國醫學創新，2012，9（2）：10-12.

[11] Rissing J P，Buxton T B，Weinstein R S，et al.Model of experimental chronic osteomyelitis in rats[J].Infect Immun，1985，53（47）：581-586.

[12] Smeltzer M S，Thomas J R，Hickmon S G，et al.Characterization of rabbit model of staphylococcal osteomyelitis[J].Orthop Res，1997，13（15）：414-421.

[13] Stefan A，Haruo S，Flock J I，et al.Development and characteri- zation of a new model of Hem atogenous osteomyelitis in the rat[J].The Journal of Infectious Disease，1995，96（15）：1230-1236.

[14] Fitzgerald R H.Experimental osteomyelitis： description of a canine model and the role depot administration of antibioties in the prevention and treatment of sepsis[J].Bone and Joint Surg，1983，65-A（3）：371.

[15] Norden C W，Shafferm M. Experimental osteomyelitis due to staphylococcus aureus or pseudomonas aeruginosa： a radiographic-pathological correlative analysis[J].Br J Exp Pathol，1980，61（4）：451-460.

（收稿日期：2014-03-26） （本文編輯：蔡元元）

綜上所述，該法操作容易掌握，效果明確，為制造Wistar大鼠脛骨骨髓炎骨缺損模型的良好方法。

參考文獻

[1]劉玉新，馮秀利，鄒林，等.帶血管局部肌瓣轉移治療股骨骨折術后慢性骨髓炎[J].中華顯微外科，2008，30（31）：138-140.

[2]劉勇.中西醫結合治療創傷性骨髓炎的臨床分析[J].中外醫學研究，2012，10（28）：131-132.

[3]譚美蘭.心理護理干預對骨髓炎手術患者身體恢復的影響探究[J].中國醫學創新，2012，9（27）：54-55.

[4]羅德軍，趙宏斌，周旭，等.脈沖沖洗加負壓封閉引流及開放植骨治療慢性骨髓炎[J].中國骨傷，2010，17（23）：631-633.

[5]劉成龍，郭亭，高杰，等.糖尿病并發慢性骨髓炎的臨床治療方法探討[J].中國骨傷，2013，26（2）：165-167.

[6]翟建國，周碩霞，叢海渡，等.游離皮瓣移植結合骨段滑移技術治療脛骨骨髓炎骨缺損[J].中華顯微外科雜志，2012，8（35）：327-329.

[7]劉立峰，鄒林，曹學成，等.脛骨慢性骨髓炎的顯微外科治療[J].中華顯微外科雜志，2012，33（5）：419-421.

[8]嚴智文，董河，馮偉，等.改良血管阻塞方法建立大鼠全腦缺血模型[J].中國醫學創新，2013，10（1）：1-3.

[9]臧福才，唐偉，白鷹.丁苯酞對大鼠腦缺血再灌注損傷神經保護作用的研究[J].中國醫學創新，2013，10（9）：15-16.

[10]顧文浩，胡嵐祥，徐祝軍，等.環扎大鼠脊髓損傷早期不同時機減壓后光密度測量熱休克蛋白70的表達及其與神經細胞凋亡的相關性研究[J].中國醫學創新，2012，9（2）：10-12.

[11] Rissing J P，Buxton T B，Weinstein R S，et al.Model of experimental chronic osteomyelitis in rats[J].Infect Immun，1985，53（47）：581-586.

[12] Smeltzer M S，Thomas J R，Hickmon S G，et al.Characterization of rabbit model of staphylococcal osteomyelitis[J].Orthop Res，1997，13（15）：414-421.

[13] Stefan A，Haruo S，Flock J I，et al.Development and characteri- zation of a new model of Hem atogenous osteomyelitis in the rat[J].The Journal of Infectious Disease，1995，96（15）：1230-1236.

[14] Fitzgerald R H.Experimental osteomyelitis： description of a canine model and the role depot administration of antibioties in the prevention and treatment of sepsis[J].Bone and Joint Surg，1983，65-A（3）：371.

[15] Norden C W，Shafferm M. Experimental osteomyelitis due to staphylococcus aureus or pseudomonas aeruginosa： a radiographic-pathological correlative analysis[J].Br J Exp Pathol，1980，61（4）：451-460.

（收稿日期：2014-03-26） （本文編輯：蔡元元）

綜上所述，該法操作容易掌握，效果明確，為制造Wistar大鼠脛骨骨髓炎骨缺損模型的良好方法。

參考文獻

[1]劉玉新，馮秀利，鄒林，等.帶血管局部肌瓣轉移治療股骨骨折術后慢性骨髓炎[J].中華顯微外科，2008，30（31）：138-140.

[2]劉勇.中西醫結合治療創傷性骨髓炎的臨床分析[J].中外醫學研究，2012，10（28）：131-132.

[3]譚美蘭.心理護理干預對骨髓炎手術患者身體恢復的影響探究[J].中國醫學創新，2012，9（27）：54-55.

[4]羅德軍，趙宏斌，周旭，等.脈沖沖洗加負壓封閉引流及開放植骨治療慢性骨髓炎[J].中國骨傷，2010，17（23）：631-633.

[5]劉成龍，郭亭，高杰，等.糖尿病并發慢性骨髓炎的臨床治療方法探討[J].中國骨傷，2013，26（2）：165-167.

[6]翟建國，周碩霞，叢海渡，等.游離皮瓣移植結合骨段滑移技術治療脛骨骨髓炎骨缺損[J].中華顯微外科雜志，2012，8（35）：327-329.

[7]劉立峰，鄒林，曹學成，等.脛骨慢性骨髓炎的顯微外科治療[J].中華顯微外科雜志，2012，33（5）：419-421.

[8]嚴智文，董河，馮偉，等.改良血管阻塞方法建立大鼠全腦缺血模型[J].中國醫學創新，2013，10（1）：1-3.

[9]臧福才，唐偉，白鷹.丁苯酞對大鼠腦缺血再灌注損傷神經保護作用的研究[J].中國醫學創新，2013，10（9）：15-16.

[10]顧文浩，胡嵐祥，徐祝軍，等.環扎大鼠脊髓損傷早期不同時機減壓后光密度測量熱休克蛋白70的表達及其與神經細胞凋亡的相關性研究[J].中國醫學創新，2012，9（2）：10-12.

[11] Rissing J P，Buxton T B，Weinstein R S，et al.Model of experimental chronic osteomyelitis in rats[J].Infect Immun，1985，53（47）：581-586.

[12] Smeltzer M S，Thomas J R，Hickmon S G，et al.Characterization of rabbit model of staphylococcal osteomyelitis[J].Orthop Res，1997，13（15）：414-421.

[13] Stefan A，Haruo S，Flock J I，et al.Development and characteri- zation of a new model of Hem atogenous osteomyelitis in the rat[J].The Journal of Infectious Disease，1995，96（15）：1230-1236.

[14] Fitzgerald R H.Experimental osteomyelitis： description of a canine model and the role depot administration of antibioties in the prevention and treatment of sepsis[J].Bone and Joint Surg，1983，65-A（3）：371.

[15] Norden C W，Shafferm M. Experimental osteomyelitis due to staphylococcus aureus or pseudomonas aeruginosa： a radiographic-pathological correlative analysis[J].Br J Exp Pathol，1980，61（4）：451-460.

（收稿日期：2014-03-26） （本文編輯：蔡元元）