EGF和TGF-a在子宮內膜癌中的表達

李 洋，朱穎軍，石巖蓉，林琬君

（天津醫科大學研究生院2011級，天津 300070；2.天津市中心婦產科醫院婦科，天津 300100）

子宮內膜癌（Endometrial Carcinoma，EMC）是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一，近年來發病率成上升趨勢，且日趨年輕化，子宮內膜癌和宮頸癌的發病比率已從 60 年代的 1∶10 變為現今的 1∶1［1］。 據文獻［2］報道，丹麥每年有近600個新發病例，從而成為歐洲子宮內膜癌發病率最高的國家之一。有文獻［3］報道，子宮內膜癌5年以上生存率為70%，5年生存率為81%，被認為是可治愈癌癥。表皮生長因子（EGF）相關蛋白包括 EGF、轉換生長因子 a（TGF－a）、補體受體（CR）、雙調蛋白（AR）和 EGF 受體（EGFR）。EGF家族普遍存在于人類的各個組織器官中，并且在胚胎形成、生長、增殖和分化等各個時期發揮著關鍵性的作用，同時它也參與了腫瘤的增殖、遷移、浸潤、分化和血管的形成［4］。近年來，EGF相關蛋白在子宮內膜癌中的表達情況也逐漸受到了人們的關注。

1 材料與方法

1.1 標本采集

收集天津市中心婦產科醫院2012年1月至2013年 1月的子宮內膜病理切片（石蠟）標本98例，年齡31～88歲，平均59.4歲。其中正常子宮內膜14例，增生性子宮內膜18例，子宮內膜癌66例（均為子宮內膜樣腺癌）。66例子宮內膜癌中，Ⅰ級:高分化（WD）23 例；Ⅱ級:中分化（MD）19 例；Ⅲ級:低分化（LD）24例。患者術前均未接受過類固醇激素及放、化療的治療。

1.2 主要試劑

EGF、TGF－a（1∶1000）單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；鼠源、兔源二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；PCR引物購自北京賽百勝生物公司（表1）；反轉錄試劑SYBR Premix Ex Taq和引物購自德國QIAGEN公司（Valencia,CA）；倒置顯微鏡、分光光度計、mRNA檢測儀（美國Bio－Rad公司）realtime PCR 檢測儀（美國 Bio－Rad公司）。

表1 EGF、TGF-a引物序列

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學

取石蠟切片常規進行甲醇脫蠟，乙醇脫水；3%H2O237℃ 孵育10 min，抗原修復，血清稀釋液封閉，一抗（EGF、TGF－a 1∶100）4 ℃ 過夜，PBS 沖洗 3次，加二抗室溫 2 h，DAB染色，以細胞膜或胞質中出現黃色或棕黃色顆粒視為著色細胞（著色細胞＞50%判定為陽性結果）。記錄陽性結果的病例數。

1.3.2 Real－time PCR

從組織細胞中提取RNA，用分光光度計檢測RNA濃度和吸光值，將提取的1 μg RNA加到20 μL體系中進行逆轉錄反應合成cDNA，之后用realtime PCR檢測儀進行qPCR實驗，程序設定為初步變性95℃ 10 min，樣本經過45次擴充循環，模板變性95℃30 s，退火60℃30 s，延伸階段72℃30 s。結果統計:用每個目的基因的Ct值減去對應的βactin Ct值，得到△Ct，每個目的基因的相對表達量表示為2－△Ct，然后對各個樣本的表達量進行比較。

1.4 統計學方法

采用Excel 2003，使用student-t檢驗和χ2檢驗方法分析實驗結果，檢測水準雙側α=0.05。

2 結果

2.1 EGF、TGF-a蛋白在正常子宮內膜、增生性子宮內膜和子宮內膜癌中的表達

免疫組織化學結果示:EGF在正常子宮內膜組、增生性子宮內膜組及子宮內膜癌組中的陽性表達率分別為 71.4%、72.2%和 57.6%，子宮內膜癌組的陽性表達率明顯低于正常子宮內膜組及增生性子宮內膜組（均 P＜0.05）；TGF－a 在正常子宮內膜組、增生性子宮內膜組及子宮內膜癌組中的表達率分別為 42.9%、44.4%和 66.7%，子宮內膜癌組的陽性表達率明顯高于正常子宮內膜組和增生性子宮內膜組（均 P＜0.05）。 見表 2。 用 Real－time PCR 方法檢測正常子宮內膜組和子宮內膜癌組組織中EGF及TGF－a的表達，結果與免疫組織化學檢測結果相一致，EGF在子宮內膜癌中相對低表達，TGF－a在子宮內膜癌中呈高表達（P＜0.05），見圖 1。

表2 3組子宮內膜組織中EGF、TGF-a的表達

圖1 子宮內膜癌中EGF及TGF-a的表達

2.2 EGF、雌二醇（E2）及TGF-a在不同分化程度子宮內膜癌中的表達

采用Real-time PCR方法分別檢測高、中、低分化的子宮內膜癌中EGF、TGF-a及E2的表達，結果顯示:EGF在不同分化程度的子宮內膜癌中的表達無明顯差異；E2在高分化的子宮內膜癌中表達程度較高，而TGF-a在低分化的子宮內膜癌中呈現高表達（圖 2）。

圖2 不同分化程度子宮內膜癌中EGF及TGF-a的表達

3 討論

EGF是Cohen（1962）首次在小鼠的頜下腺中發現的一種小分子蛋白，能夠通過自分泌或旁分泌的方式，影響細胞的增殖、分化及功能活化，在人類多種腫瘤的發生發展中起著重要的作用［5］。EGF相關蛋白包括 EGF、TGF-a、CR、AR 和 EGFR。 EGFR 是具有配體介導的酪氨酸激酶活性的多功能跨膜蛋白，是定位于人第7號染色體斷臂的原癌基因C-erbB-1 的表達產物，分子質量為 170 ku［5］。 EGFR 作為EGF和TGF-a的受體。通過與配體結合后獲得酪氨酸激酶活性，刺激酪氨酸激酶通路，從而促進細胞的惡變。最近的研究表明，AR也是通過EGFR解旋活化的［6］。CR的受體目前仍不確定。

Sebastaian 等［7］指出，EGFR 至少與 33%～50%的人類表皮腫瘤相關，是表皮腫瘤治療的重要靶點。此外，EGFR在許多腫瘤細胞中均為高表達，包括頭頸部癌、乳腺癌、腎癌、宮頸癌和食管癌等。Livasy等［8］研究發現，EGFR表達陽性的子宮內膜癌患者的總生存時間明顯短于EGFR表達陰性的患者，表明EGFR在子宮內膜癌的形成中具有非常重要的作用。研究還發現，EGFR的突變可活化不同的下游信號途徑，不同來源的腫瘤細胞，其EGFR信號經過的下游轉導途徑也不完全相同［9］。有學者［10］提出，EGER表達的上調可作為新的判斷腫瘤侵襲、轉移和預后的分子標記物。

TGF-a是一種正常時在胚胎期分泌的生長因子，多存在于腫瘤患者的腫瘤組織中，如肺癌、肝細胞癌、膀胱癌和乳癌等，曾被報道能預示某些癌癥患者的預后情況，如肺癌和乳腺癌等［11］。TGF-a的表達與子宮內膜癌的發生和發展相關。有文獻［6］報道，TGF-a的表達和缺失是判斷某些疾病臨床分期、子宮內膜癌肌層浸潤深度等的有力指標。

本研究結果顯示，EGF在正常和增生性子宮內膜中表達水平較高，在子宮內膜癌中的表達水平低于正常及增生性子宮內膜；TGF-a在子宮內膜癌中的陽性表達率高達66.7%，并且與癌組織的低分化水平有關。以上結果提示:EGF及TGF-a的變化在子宮內膜癌的發生發展上有著重要的作用。

子宮內膜上皮和乳腺上皮是雌激素主要的作用靶點，雌激素能夠促進這些細胞的增殖，并與它們的癌變有關。Livasy等［8］研究發現，EGFR在乳腺癌中表達明顯增加，腫瘤浸潤組高于非浸潤組、淋巴轉移組高于非轉移組，認為EGFR高表達與乳腺癌發生及轉移存在相關性。

在靶細胞中，雌激素通過雌激素受體相結合而發揮生物學作用。據有關文獻［12］報道，E2的免疫反應與組織學水平和臨床分期相關，在腫瘤中EGF和EGFR的陽性表達分別為25.6%和53.1%，這與腫瘤自身的組織學水平和臨床分期并無明顯的相關性；另一方面，TGF－a在子宮內膜癌中的表達率可達到67.0%，并且與組織的的低分化水平和臨床分期有關。這與本研究結果相一致。

國外 Niikyra 等［6］報道，TGF－a 與 EGFR 在癌組織中的表達存在緊密的關聯性，而EGFR和EGF之間并未檢測到明顯的相關性；EGFR、EGF、TGF－a 和CR在正常子宮內膜和增生性子宮內膜中都存在表達，但免疫學反應都不強烈；在正常子宮內膜和增生性子宮內膜中，TGF－a的表達通常與ER和PR共存。這些研究表明，在正常子宮內膜和增生性子宮內膜中，TGF－a的表達是雌激素依賴的。有學者［13］提出，E2在正常子宮內膜中的促有絲分裂效應可能是通過EGF/TGF－a活化的；EGF的表達與患者的年齡有密切的關系，而子宮內膜癌中EGFR和TGF－a的表達和缺失與其臨床分期及子宮肌層的浸潤深度相關。有文獻［14－17］報道稱，在低分化的子宮內膜癌中TGF－a/EGFR是通過自分泌和旁分泌的方式，而不是EGF/EGFR通路促進子宮內膜癌發展的，而在高分化子宮內膜癌中，TGF－a的表達類似于正常子宮內膜和增生性子宮內膜，為雌激素依賴性的。

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