高血壓大鼠穹窿下器神經(jīng)元型一氧化氮合酶陽(yáng)性神經(jīng)元的表達(dá)及意義

郭建美

穹窿下器(subfornical organ，SFO)是感受性室周器官之一，缺乏血腦屏障，研究證實(shí)其與飲水、血壓等多方面的調(diào)節(jié)有關(guān)［1］。穹窿下器內(nèi)含有一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，NOS)陽(yáng)性神經(jīng)元，而一氧化氮是血壓調(diào)節(jié)的重要信息分子之一，其在神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富，且與高血壓的發(fā)生密切相關(guān)［2］。有研究顯示，NO缺乏可能是高血壓發(fā)生的原因之一［3］。本文用ABC免疫細(xì)胞化學(xué)方法，觀察高血壓大鼠SFO內(nèi)神經(jīng)元型NOS(nNOS)陽(yáng)性神經(jīng)元的變化，探討SFO內(nèi)nNOS免疫陽(yáng)性神經(jīng)元在高血壓形成和發(fā)展過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制備 選擇雌性Wistar大鼠(清潔級(jí)，體重230～250 g，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供)40只，隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組(n=30)和對(duì)照組(n=10)。實(shí)驗(yàn)組予以左旋硝基精氨酸(L-NNA)15 mg·d-1·kg-1，分別于上午 8∶00、下午 8∶00 兩次腹腔注射，制備高血壓動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)組根據(jù)動(dòng)物血壓及腹腔注射時(shí)間分為3組:用藥2周組、用藥4周組和用藥8周組，每組10只。對(duì)照組不做任何處理。

1.2 動(dòng)物血壓的測(cè)量［4］應(yīng)用大鼠生理記錄儀采用尾部套囊的方法測(cè)量收縮期血壓。測(cè)定條件:環(huán)境安靜，溫度30℃，測(cè)量前將大鼠放入暖箱中使其身體暖和并適應(yīng)其環(huán)境15～30 min，到時(shí)間后將大鼠取出放入鼠袋中留出全部鼠尾，并放入儀器中固定位置，在尾根部套入環(huán)式氣囊，進(jìn)行血壓測(cè)定并讀取數(shù)據(jù)。必須在大鼠安靜狀態(tài)下測(cè)定3次，取其平均值。適應(yīng)性喂養(yǎng)期間每隔1 d測(cè)血壓1次，主要目的是使大鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。分組后每周測(cè)血壓1次。

1.3 高血壓的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) 目前國(guó)際上還沒有大鼠動(dòng)態(tài)血壓正常值及高血壓的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)美國(guó)和歐洲最新公布的高血壓治療新指南［5］(JNC-T指南和ESH/ESC指南)及張維忠等［6］建議的動(dòng)態(tài)血壓暫時(shí)參考標(biāo)準(zhǔn)，本研究規(guī)定大鼠動(dòng)態(tài)血壓的收縮壓/舒張壓符合白晝 ＞150/100 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，夜間 ＞140/90 mm Hg時(shí)為高血壓。

1.4 光鏡樣品制備 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予10%水合氯醛按0.3 ml/100 g體重麻醉后，經(jīng)左心室灌注37℃預(yù)熱的0.9%氯化鈉溶液200～250 ml，后灌注4℃ 4%多聚甲醛150 ml(先快后慢，25 min內(nèi)灌注完畢)，取腦后立刻將腦組織放入4%多聚甲醛4℃后固定，8 h后將腦組織分別沿視交叉前方和垂體根部后方冠狀位切開，取SFO相應(yīng)腦區(qū)3～4 cm厚度組織，放入4%多聚甲醛中繼續(xù)后固定12 h。后固定結(jié)束后選取包含有穹窿下器的腦塊，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)石蠟切片，片厚5μm，nNOS免疫組織化學(xué)顯色、封片。顯微鏡觀察、攝片。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法 取上述HE染色的相鄰切片:(1)常規(guī)脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇至水。(2)0.01 mol/L pH=7.4 PBS浸泡5 min。(3)封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶:切片入10%H2O2/甲醇室溫下浸泡15 min。(4)抗原修復(fù):將切片浸入枸櫞酸緩沖液，在免疫組化專用微波爐中進(jìn)行微波修復(fù)20 min，室溫下自然冷卻。(5)封閉非特異抗原:10%山羊血清封閉，室溫下30 min。(6)加入一抗:4℃冰箱孵育過(guò)夜，以不加一抗而用PBS緩沖液代替的切片同時(shí)染色，做陰性對(duì)照。(7)加入二抗:生物素化羊抗兔IgG，37℃下孵育30 min。(8)加入三抗:，加入鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物，即SABC，37℃下孵育20 min。(9)DAB室溫下顯色5～10 min，待顯色完全后自來(lái)水終止顯色。(10)常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。Olympus萬(wàn)能照相機(jī)觀察照像。

1.6 圖像分析 選取10×40倍視野調(diào)整好顯微鏡的光源強(qiáng)度使之保持不變，對(duì)穹窿下器進(jìn)行掃描。掃描過(guò)程中保持4個(gè)固定，即:(1)顯微鏡的光源強(qiáng)度固定;(2)曝光數(shù)固定;(3)白平衡值固定;(4)視場(chǎng)域大小固定。每只大鼠具有以上部位的切片各選5張，每張切片選以上部位結(jié)構(gòu)清楚的5個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行畫分割，然后選取平均灰度值這個(gè)參數(shù)進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算機(jī)直接得到這項(xiàng)指標(biāo)的平均值。平均灰度值反應(yīng)組織、細(xì)胞的明暗，間接反應(yīng)所含化學(xué)物質(zhì)的多少，數(shù)值越大表明含量越少。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)分析，進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 L-NNA的升壓效應(yīng) 尾壓測(cè)量L-NNA給藥前對(duì)照組和模型組的收縮壓差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。L-NNA用藥2、4、8周，模型組的收縮壓均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。L-NNA用藥2周后，模型組形成了高血壓(159.6 mm Hg＞150.0 mm Hg)。此后，血壓繼續(xù)升高，到用藥4周時(shí)，血壓升至(171±8)mm Hg，此后，血壓升高緩慢，穩(wěn)定在此水平。見表1。

表1 給L-NNA后血壓隨時(shí)間的變化n=10，mm Hg，±s

表1 給L-NNA后血壓隨時(shí)間的變化n=10，mm Hg，±s

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別 2周 4周 8周112±8 109±7 111±7模型組 160±8* 171±8* 173±8對(duì)照組*

2.2 鏡下觀察結(jié)果 對(duì)照組:在冠狀切片上可見nNOS免疫陽(yáng)性細(xì)胞排列密集，單個(gè)細(xì)胞形態(tài)較清晰，均勻分布于整個(gè)SFO內(nèi)，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，位于胞質(zhì)，胞核不著色，細(xì)胞胞體中等大小，呈圓形或橢圓形，突起較短或不明顯，灰度值測(cè)定為(179.24±9.62)。模型組:用藥2周組陽(yáng)性細(xì)胞在SFO背側(cè)部及兩背側(cè)邊緣帶的大血管周圍分布較密集，細(xì)胞呈棕褐色，胞體中等大小，形態(tài)多樣，呈圓形、梭型或三角形，有些可見由胞體發(fā)出的短突起灰度值測(cè)定為(159.32±7.22)。用藥4周組陽(yáng)性細(xì)胞著色變淺，呈棕黃色。胞體呈圓形或橢圓形，未見明顯突起灰度值測(cè)定為(192.48±6.02)。用藥8周組陽(yáng)性細(xì)胞呈淡黃色。胞體呈球形，未見明顯突起灰度值測(cè)定為(191.78±5.84)。見圖1～4，表2。

圖1 對(duì)照組(HE×400)

圖2 用藥2周組(HE×400)

圖3 用藥4周組(HE×400)

圖4 用藥8周組(HE×400)

表2 不同組別nNOS陰性細(xì)胞的變化±s

表2 不同組別nNOS陰性細(xì)胞的變化±s

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與用藥2周比較，#P＜0.05

組別 2周 4周 8周179±10 179±10 179±10模型組 159±7* 192±6*# 192±6*#對(duì)照組

3 討論

高血壓是常見病和多發(fā)病，可引起心、腦、腎等靶器官的損害。高血壓的發(fā)生和體內(nèi)NO的減少有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)參考近年來(lái)有關(guān)方法［7］用一氧化氮合酶抑制劑—L-NNA腹腔注射大鼠來(lái)復(fù)制NO缺乏型高血壓大鼠模型。腹腔注射L-NNA后3 d，大鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、順從、反抗能力減低、攝食、飲水較正常組為多等臨床癥狀。L-NNA給藥2周后血壓升至159.6 mm Hg，符合高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)。提示此種方法造模成功。在造的45只動(dòng)物模型中，有3只不明原因死亡，其余42只全部達(dá)到高血壓標(biāo)準(zhǔn)，造模成功率達(dá)90%以上。

SFO位于第三腦室前背側(cè)壁、海馬連合腹側(cè)穹窿腳分歧處，恰在兩個(gè)側(cè)腦室與第三腦室頂之間，在垂直軸上或矢狀切面上，恰好平對(duì)室間孔平面，屬于感受性室周器官(sensory circumventricular organs，SCVOs)［1］。多年來(lái)人們對(duì)其形態(tài)結(jié)構(gòu)己有了較深的認(rèn)識(shí)，有研究認(rèn)為，感受性室周器官即可能作為腦的開窗來(lái)感受外周血攜信息的變化［1］。SFO缺乏血腦屏障，與其他部位相比可能會(huì)更早的接觸血攜信息，而提前發(fā)生改變。Gaillard等［8］研究證實(shí)，腹腔注射內(nèi)毒素(LPS)主要經(jīng)室周器官等缺乏血腦屏障的位點(diǎn)、血腦屏障位點(diǎn)及某些傳入性神經(jīng)纖維(如迷走神經(jīng))入腦。朱望東等［9］研究發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用不同劑量的LPS后，SFO部位較早出現(xiàn)一氧化氮合酶(nitri coxide synthas，NOS)蛋白表達(dá);Quan等［10］曾觀察了在外周給予內(nèi)毒素后，IL-10 mRNA表達(dá)的時(shí)程變化，發(fā)現(xiàn)SFO處為最早表達(dá)的部位之一，并從SFO處起始逐漸向腦內(nèi)表達(dá)到高峰。

nNOS免疫組化結(jié)果顯示，在用藥2周組，穹窿下器內(nèi)nNOS免疫陽(yáng)性細(xì)胞灰度值較正常組降低，此種現(xiàn)象未見相關(guān)報(bào)道。在用藥4周組，穹窿下器內(nèi)nNOS免疫陽(yáng)性細(xì)胞灰度值較正常組增加，這與李紅等［11］的報(bào)道一致。在用藥8周組，nNOS免疫陽(yáng)性細(xì)胞灰度值和用藥4周組相似。灰度值反應(yīng)組織、細(xì)胞的明暗，間接反應(yīng)所含化學(xué)物質(zhì)的多少，數(shù)值越大表明含量越少。在本研究中隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，在SFO的nNOS免疫陽(yáng)性細(xì)胞染色呈現(xiàn)先增加后減低的規(guī)律。這提示在用藥初期，NO水平降低，被SFO感知后產(chǎn)生相關(guān)反應(yīng)，分泌對(duì)nNOS敏感的相關(guān)物質(zhì)，從而表現(xiàn)為高表達(dá)。而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠體內(nèi)的NO水平最終下降并達(dá)到另一個(gè)新的水平，SFO不再能感知到NO的水平波動(dòng)，故而nNOS相關(guān)物質(zhì)的分泌減少，故轉(zhuǎn)為低表達(dá)。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)SFO在體內(nèi)NO水平波動(dòng)時(shí)在形態(tài)學(xué)方面發(fā)生了明顯的變化，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

1 Johnson AK，Gross PM.Sensory circumventricular organs and brain homeostatic pathways.J-FASEB，1993，7:678-686.

2 周初松，靳安民，馬大烈.大鼠脊髓組織一氧化氮合酶顯微及超微結(jié)構(gòu)特征.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，20:485-487.

3 郭志剛，沈建剛，翁昌鴻，等.冠心病、高血壓病人血漿氧自由基、一氧化氮及纖溶性的變化.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，19:124-126.

4 鄧江，吳芹，黃燮南.經(jīng)大鼠尾動(dòng)脈無(wú)創(chuàng)性血壓測(cè)量的方法.遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，31:184-186.

5 張維忠.美國(guó)和歐洲高血壓治療新指南評(píng)析.中華心血管病雜志，2003，31:650-652.

6 張維忠，施海明，王瑞冬等.動(dòng)態(tài)血壓參數(shù)正常參照值協(xié)作研究.中華心血管病雜志，1995，10:325-328.

7 Charpie JR，Charpie PM，Goud C，et al.Quinapri Preventshypertension andenhanced vascular veactivity innitroarginine treaterats.Blood Pressure，1997，6:117-124.

8 Gaillard RC.Interaction between the hypothalamo-pituitary-adrenal axis and the immunolo gicalsystem.Neurosci，2001，24:320-324.

9 朱望東，馬常升，曹翠麗，等.不同免疫狀態(tài)下穹窿下器的一氧化氮合酶細(xì)胞的變化.解剖學(xué)雜志，2001，24:132-135.

10 Quan N，Whiteside M，Herkenham M.Time course and localization patterns of interleukin-1 messengeger RNA expression in brain and pituitary after peripheral administrationof lipopolysaccharide.Neuroscience，1998 Mar，83:281-293.

11 李紅，徐健，徐鵬宵.自發(fā)性高血壓大鼠室周灰質(zhì)中NOS陽(yáng)性神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)觀察.武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，16:114-116.