酪氨酸分子印跡電化學傳感器的制備及性能

陳丹，連惠婷，孫向英，劉斌

（華僑大學 材料科學與工程學院，福建 廈門361021）

酪氨酸（Tyr）是腎上腺激素、去甲腎上腺激素和多巴胺等用于調節情緒的生物信號分子的重要母體之一.如果人體缺乏酪氨酸，就會出現代謝異常、智力低下、抑郁等疾病［1-2］，而過量酪氨酸攝入則會使姊妹染色單體發生改變［3］.因此，建立準確、靈敏測定酪氨酸的方法具有重要意義.檢測酪氨酸的方法主要有高效液相色譜法［4］、毛細管電泳法［5］、氣相色譜法［6］、紫外可見吸光光度法［7］、熒光光度法［8-9］等.酪氨酸具有電活性，靈敏快速的電化學傳感器法也常用于酪氨酸的檢測［10-15］.這些方法雖然展現出較高的靈敏度及較好的選擇性，但在對實際樣品中酪氨酸的準確快速檢測仍存在局限.分子印跡電化學傳感器（MIECS）因兼具分子印跡技術（MIT）對目標分子的特異識別性［16-19］和電化學檢測技術的優點，即高選擇性、高靈敏度、低成本、易于微型化和自動化［20-21］，有望改善其他方法的不足之處，實現酪氨酸的便攜、快速、準確測定.基于此，本文結合電化學的高靈敏度優勢和分子印跡技術的高選擇性特點，采用恒電位沉積得到復合物膜電極，選用適宜的洗脫劑洗脫去模板分子得到酪氨酸分子印跡電化學傳感器，并優化其電沉積時間、洗脫劑、洗脫時間等實驗條件.

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

1）儀器.CHI660D型電化學工作站，上海辰華儀器有限公司；三電極系統：玻碳電極及其修飾膜電極為工作電極，鉑絲電極為對電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極；S-4800型掃描電子顯微鏡，日本日立公司；PARSTAT2273型高級電化學工作站，美國Princeton Applied Research公司.

2）試劑.殼聚糖（CTS），AR級，德國Sigma Aldrich；DL-絲氨酸（DL-Ser），BR級，上海麗珠東風生物技術有限公司；L-酪氨酸（L-Tyr）、L-苯丙氨酸（L-phe）、L-色氨酸（L-Trp）、多巴胺（DA）、抗壞血酸（AA）、尿酸（UA），均為BR級，國藥集團化學試劑有限公司；人血清（Human serum），華僑大學校醫院提供；實驗用水均為Milli-Q系統提供的超純水，美國Millipore公司，18MΩ·cm.

1.2 酪氨酸分子印跡電化學傳感器的制作方法

將0.350 0g CTS溶解于稀HCl中，以NaOH溶液調節pH值至5.7，配制成7.0g·L-1CTS溶液.將0.018 2gL-Tyr溶解于HCl溶液中，配制成0.01mol·L-1L-Tyr溶液.取2.00mLL-Tyr與8.00mL CTS攪拌混勻，配制成含0.02mol·L-1L-Tyr，5.6g·L-1CTS的混合電沉積底液，置于4℃冰箱中避光保存備用.圓盤玻碳電極依次用不同粒徑Al2O3泥漿仔細打磨拋光，再依次經1∶1 HNO3、二次蒸餾水超聲清洗各3～5min至電極表面呈疏水鏡面，室溫下自然晾干.將以玻碳電極為工作電極的三電極系統移入上述配制的酪氨酸殼聚糖混合電沉積底液中，在-1.1V（vs.SCE）恒電位下沉積一定時間后，取出工作電極，并用少量二次蒸餾水淋洗后晾干，即制備出殼聚糖-酪氨酸聚合膜修飾電極.將電極置于0.01mol·L-1NaOH和無水乙醇的混合溶液中，施加+1.0V電壓以洗脫去模板分子，制備成保留有酪氨酸分子空穴的分子印跡電極（MIP／GCE）.

非印跡膜對照電極（NIP／GCE）的制備.除電沉積液中不含模板分子外，其他制備過程及條件與印跡電極的制備相同.

1.3 實驗方法

1.3.1 電化學方法 以0.1mol·L-1，pH值為6.0的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）為支持電解質，采用微分脈沖伏安法（DPV）進行掃描，考察工作電極在1.0×10-5mol·L-1L-Tyr溶液中的電化學響應.電位掃描范圍為0.4～1.0V，掃描速度為50mV·s-1，脈沖幅度為0.05V，脈沖周期為0.02s，脈沖寬度0.05s，靈敏度為1.0×10-6.記錄L-Tyr在工作電極上的氧化峰峰電流與電位的關系曲線.

電化學阻抗譜（EIS）實驗是在含有5mmol·L-1［Fe（CN）6］3-／4-電化學探針的0.1mol·L-1KCl溶液中進行，頻率范圍為1×10-2～1×105Hz.

1.3.2 掃描電鏡表征 將CTS，L-TyrNIP和L-TyrMIP分別電沉積于金片基底表面后，真空干燥48h.在加速電壓為5.0kV下，通過S-4800型掃描電子顯微鏡（SEM）觀察各樣品的表面形貌.

2 結果與討論

2.1 L-Tyr在復合膜修飾電極上的電化學響應

為了驗證實驗中酪氨酸分子能與殼聚糖一同沉積至電極表面并經DPV掃描溶出，考察CTS-Tyr復合膜修飾電極與CTS修飾電極在0.1mol·L-1，pH值為6.0的PBS溶液中的DPV響應，結果如圖1所示.由圖1可知：相對于CTS／GCE的DPV曲線，CTS-Tyr／GCE的DPV曲線在0.762V處有一個較強的酪氨酸特征氧化峰；而內插圖為MIP／GCE在含1.0×10-5mol·L-1L-Tyr溶液中DPV曲線，酪氨酸的氧化峰出現在0.720V.兩者氧化峰電位基本一致，可確定酪氨酸分子可與殼聚糖共同沉積至電極表面，并能通過DPV檢測出來.同時，溶液中的酪氨酸氧化峰電位較之膜上的負移了42mV，可知印跡電極表面印跡位點的存在更有利于L-Tyr在電極表面的氧化.

圖1 不同修飾電極的DPV電化學響應Fig.1 DPVs of different modified electrodes

2.2 實驗條件的優化

2.2.1 電沉積時間的選擇 電沉積時間不同，則印跡膜厚度不同，膜厚度隨沉積時間增加而變大.不導電的印跡膜越薄，目標分子通過界面的電荷轉移阻礙越小，則其對目標物質的響應越靈敏；印跡膜越厚，雖然靈敏度下降，但是其膜上印跡位點增加，印跡膜對目標物質結合量也增加.采用恒電位沉積法，得到電沉積時間不同的印跡膜電極.根據洗脫模板分子后得到的印跡膜電極對同一濃度L-Tyr溶液的DPV響應峰電流大小，來獲得最佳電沉積時間.實驗結果表明：電沉積時間小于100s時，隨沉積時間增加，響應電流逐漸增加；沉積時間為100s時，響應峰電流達到最大；而沉積時間大于100s時，由于圓盤電極表面積有限，膜太厚不利于膜中心L-Tyr的進出，影響模板分子的完全洗脫及再次識別，所以響應峰電流反而減少.因此，100s為最佳電沉積時間.

2.2.2 洗脫劑中無水乙醇含量的選擇 殼聚糖在水中溶脹度較大，顯著影響其分離選擇性能，因此必須先設法抑制其溶脹，維持其印跡空穴的剛性結構［22］.研究表明：殼聚糖具有良好的耐有機溶劑（如乙醇）性能［23］，因此，采用調節洗脫劑中乙醇的體積分數來調節殼聚糖膜的抗溶脹性能.為了選得最佳的洗脫劑，考察了0.01mol·L-1NaOH和不同體積分數的無水乙醇作為洗脫劑時，印跡膜電極對同一濃度L-Tyr溶液的響應峰電流（I）與第一次測定電流（I0）的百分比隨時間的變化.結果表明：當洗脫劑中無水乙醇的體積分數為0.5%時，酪氨酸的電化學響應峰電流基本不變；而當無水乙醇的體積分數低于或超過0.5%時，響應峰電流在一定程度上會隨著時間推移而增加或降低.由此可知，適量的乙醇增強了殼聚糖膜的致密性與穩定性，有利于印跡膜微觀構型的維持及印跡膜與目標分子間相互作用的增強.

2.2.3 洗脫時間的選擇 印跡電極的制備需經電位誘導洗脫除去膜上的模板分子，留下能與酪氨酸特異性結合的印跡位點.若洗脫時間太短，模板分子未完全洗脫，導致未洗脫掉的模板分子占據一定量的印跡位點，影響印跡膜電極對目標物質的再次識別；若洗脫時間太長，模板分子已完全洗脫，多余的電位誘導時間又會對膜的性質帶來不必要的影響.因此，需選擇最佳洗脫時間.

洗脫時間對洗脫效果的影響，如圖2所示.由圖2可知：當洗脫時間低于500s時，隨著洗脫時間增加，L-Tyr的DPV響應峰電流逐步降低，但還是有信號殘留（曲線a～d），說明未能將L-Tyr從印跡膜上洗脫下來；當洗脫時間達到500s后，電極在0.1mol·L-1pH 6.0PBS中的DPV曲線（曲線e）上基本沒有L-Tyr的特征峰，表明洗脫劑已將L-Tyr完全洗脫.后續試驗中還發現，該印跡膜電極對L-Tyr的響應穩定.因此，認為500s為最適宜的洗脫時間.

將三電極系統在含0.02mol·L-1L-Tyr的殼聚糖混合電沉積液中，于-1.1V恒電位下沉積100s，用少量二次水淋洗后晾干.然后，將制得的聚合膜修飾電極在+1.0V電位下，于0.01 mol·L-1NaOH和0.5%無水乙醇混合液中，恒電位洗脫500s，即制得對L-Tyr具有良好電化學響應的酪氨酸分子印跡電極.

圖2 洗脫時間對洗脫效果的影響Fig.2 Impact of different elution time on the elution effect

2.3 酪氨酸分子印跡傳感器的修飾膜表征

2.3.1 SEM表征 采用SEM表征可得印跡膜的形貌及微觀結構，如圖3所示.裸金電極表面呈平整剛性的結構（圖3（a））；電沉積上CTS后，其表面可以觀察到致密的薄膜結構（圖3（b），（c））；當L-Tyr從復合物膜中洗脫后，印跡膜表面呈現疏松多孔結構（圖3（d）），有利于模板分子的進出.

圖3 電極表面不同修飾膜的SEM圖Fig.3 SEM images of Au disk surface modified with different materials

2.3.2 EIS表征 采用EIS研究電極表面與溶液之間的電荷轉移，不同電極的交流阻抗圖譜如圖4所示.交流阻抗圖由預示膜阻抗的高頻區半圓（Rp）和溶液擴散電阻的低頻區直線（Rs）組成.由圖4可知：裸電極（曲線a）的交流阻抗曲線近似為直線，表明此時［Fe（CN）6］3-／4-在裸電極上的反應主要受溶液擴散控制；當電極表面電沉積上CTS（曲線c）以及CTS-Tyr復合物（曲線d）后，形成的復合物膜使［Fe（CN）6］3-／4-在電極界面的電荷轉移受阻，產生膜阻抗，Rp值分別增大至431.3，470.5Ω；而隨著酪氨酸的洗脫（曲線b），Rp降至304.2Ω，說明洗脫模板分子后，膜上留下的印跡空穴使得［Fe（CN）6］3-／4-到達電極表面變得容易.

圖4 不同電極的交流阻抗圖譜Fig.4 EIS of GCE modified with different material

2.4 酪氨酸分子印跡傳感器的特異識別性能

2.4.1 抗干擾性能 為了考察所制備的印跡電極抗其他共存物質的干擾性能，參考了血清中幾種物質的相對酪氨酸含量.模擬血清中各物質的含量相對于酪氨酸含量的比率，如表1所示.測定了當不同濃度倍數的共存物質存在下，印跡電極對濃度為1.0×10-5mol·L-1L-Tyr的DPV響應峰電流與不存在干擾時的峰電流比值（I／I0），如圖5所示.

由圖5可知：在遠超過其理論相對含量的共存干擾存在下，所制得的印跡傳感器對同等濃度酪氨酸的電化學響應峰電流變化在可接受的波動范圍內.因此，該傳感器可以應用于實際樣品的檢測.

表1 抗干擾實驗溶液配制表Tab.1 Preparation of mixture solutions in the anti-interence experiment

圖5 不同干擾物存在時，印跡傳感器對酪氨酸的響應電流變化Fig.5 I／I0of the MIP sensor for L-Tyr in the presence of dirrerent co-existing substances in blood serum

2.4.2 吸附等溫曲線研究及工作曲線 吸附等溫線是評價印跡膜親和性能的主要方法.為了模擬酪氨酸分子印跡電化學傳感器吸附酪氨酸分子的等溫吸附模型，參考Langmuir吸附模型［26］，提出一個適合本體系的擬合公式，即

式（1）中：Ip為分子印跡傳感器吸附達到平衡時，印跡膜上的的平衡吸附不同濃度酪氨酸時的響應電流值，μA；c為吸附平衡時溶液中酪氨酸的濃度，μmol·L-1；Ipm為飽和吸附狀態下的響應電流值，μA；k為吸附平衡解離常數，μmol·L-1.而印跡膜的印跡效果，可以用印跡因子IF表示，即IF＝Ipm（MIP）／Ipm（NIP）.IF越大，說明印跡膜的識別性強，印跡效果越好.

制備NIP和MIP兩種電化學傳感器，分別作其對L-Tyr的等溫吸附曲線，如圖6所示.由圖6（a）可知：L-Tyr在印跡傳感器上的DPV響應明顯大于非印跡傳感器.表2為平衡吸附等溫曲線參數擬合表.從表2的擬合數據可知：飽和狀態下的響應電流值MIP明顯大于NIP，IF可達3.34，表明印跡傳感器對酪氨酸具有較好的識別性能.

圖6 印跡與非印跡傳感器對酪氨酸分子的等溫吸附曲線Fig.6 Adsorption isotherm curves of L-Tyr on MIP and NIP sensors

解離常數k反映解離反應的快慢，k越小說明解離越慢，解離程度越低，代表膜與分子之間的親和力越強.表2中：印跡膜的k明顯小于非印跡膜的，同樣說明了印跡膜對L-Tyr特異性識別.

由圖6（b）可知：酪氨酸印跡傳感器對L-Tyr的響應峰電流在4.0×10-7～1.0×10-4mol·L-1濃度范圍，呈現良好的線性變化，線性方程為Ip＝0.008 78c+0.003 52，R2＝0.999 1，定量檢出下限達2.0×10-7mol·L-1.

表2 平衡吸附等溫曲線參數擬合表Tab.2 Values of isotherm adsorption model parameters

2.5 重現性和穩定性

將所制備的酪氨酸分子印跡電極重復洗脫，測定其對1.0×10-5mol·L-1L-Tyr的電化學響應.結果表明：所得Ip的標準偏差為0.81%（n＝10），說明該傳感器重現性較好.每天使用一次該傳感器，連續使用一周后，Ip變化為初始值的99.76%，說明該電化學傳感器具有較好的穩定性.

2.6 血清樣品分析及回收率的測定

自然界中的氨基酸和糖有左旋和右旋，但在生命體中，只有左旋的氨基酸和右旋的糖，即生命體中只有L-型氨基酸和D-型糖.

將印跡傳感器用于血清樣品中L-Tyr的測定，采用加標回收法測回收率，結果如表3所示.表3中：cd為樣品測定值；ca為加入量；cf為測得量；η為回收率.由表3可知：MIP／GCE用于血清樣品中L-Tyr含量的測定，平均回收率在89.50%～99.67%之間.

表3 血清樣品中酪氨酸的測定Tab.3 Determination of the tyrosine in human serum samples

3 結束語

采用分子印跡技術，借助功能基體殼聚糖的電沉積制備了L-Tyr分子印跡電極，通過DPV法考察其對L-Tyr的響應情況.在最佳制備條件下，所構建的印跡膜傳感器對L-Tyr具有很好的靈敏度和特異識別性，同時也有較低的檢測限和較好的重現性及穩定性.印跡膜傳感器良好的抗干擾性能，使其成功地應用于血清中L-Tyr的測定.實驗結果表明：其在臨床診斷中，對血清酪氨酸的快捷、準確檢測具有潛在的應用價值.

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