胃鏡活檢組織RASSF1基因啟動子甲基化檢測及其臨床意義分析＊

楊 軍，關秀文，牛彥鋒，杜寒松，翟榮林，曾 榮，張萬里（.黃陂區人民醫院外一科，武漢 4000；華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院：.胃腸外科；.肝膽外科；4.腫瘤中心，武漢 400）

胃癌的發病機制與表觀遺傳學密切相關，其中抑癌基因甲基化調控異常是其最重要的發病機制，相關的基因包括RAS相關結構域蛋白1（RASSF1）編碼基因等［1－2］。RASSF1基因是在從3號染色體短臂克隆獲得的一種新的抑癌基因，所編碼的RASSF1蛋白通過RAS介導的信號通路發揮促進細胞凋亡的生物學效應。目前已證實RASSF1基因在胃癌組織中的表達水平顯著低于正常組織，且表達水平與臨床病理因素密切相關，可用于胃癌患者病情判斷及預后評估［3－4］。本研究基于基因甲基化與蛋白質表達的關系，分析了胃癌患者胃鏡活檢組織RASSF1基因啟動子甲基化水平，探討RASSF1基因啟動子甲基化在胃癌診斷及患者病情判斷、預后評估中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年1月至2013年6月行胃鏡檢查的胃癌患者75例納入患者組（GAC組），均經體格檢查、影像學檢查、胃鏡活檢標本和手術切除標本病理組織學檢查確診。75例患者中，男40例、女35例，年齡30～75歲，平均（51.2±12.6）歲。同期胃鏡檢查正常的健康者75例納入對照組（CON組），男39例、女36例，年齡30～75歲，平均（50.7±12.3）歲。兩組研究對象間性別構成和年齡分布比較差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法 采集GAC組患者胃鏡活檢癌組織和癌旁組織標本，以及CON組健康者正常胃組織標本。參照基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取組織標本DNA，提取后的DNA經純化后用于檢測RASSF1基因啟動子甲基化水平。采用甲基化檢測試劑盒對DNA標本進行重亞硫酸鹽轉化，再對RASSF1基因啟動子甲基化狀態進行檢測。采用甲基化特異性聚合酶鏈反應（MSP）檢測RASSF1基因啟動子甲基化狀態。引物設計采用 Methprimer軟件（http：／／www.urogene.org／cgi－bin／methprimer／methprimer.cgi），引物序列見表1。MSP擴增體系為25μL，循環條件為：95℃10min，95℃1 min、64℃45s、72℃30s循環25次，72℃10min。擴增后的產物經凝膠電泳后顯影檢測。

表1 RASSF1基因啟動子MSP檢測引物序列

1.3 統計學處理 采用SPSS12.0統計學軟件進行數據處理與分析。計數資料采用百分率表示，組間比較采用卡方檢驗；顯著性檢驗水準α＝0.05，P＜0.05為比較差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 RASSF1基因啟動子甲基化比較 75例GAC組患者癌組織及癌旁組織標本中，47例癌組織標本檢出RASSF1基因啟動子甲基化，甲基化率為62.7%，3例癌旁組織標本檢出RASSF1基因啟動子甲基化，甲基化率為4.0%。75例CON組健康者正常組織標本中，2例檢出RASSF1基因啟動子甲基化，甲基化率為2.7%。GAC組患者癌組織標本RASSF1基因啟動子甲基化率高于癌旁組織和CON組健康者正常組織，比較差異均有統計學意義（P＜0.05），癌旁組織和正常組織RASSF1基因啟動子甲基化率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 RASSF1基因啟動子甲基化與臨床病理因素的關系 胃癌患者癌組織RASSF1基因啟動子甲基化率在不同性別、年齡、病變部位及幽門螺桿菌（HP）感染患者之間的比較差異無統計學意義（P＞0.05），在不同分化程度、腫瘤最大徑、淋巴結轉移、遠處轉移和TNM分期患者間的比較差異均有統計學意義（P＜0.05），分化程度高、無淋巴結轉移、無遠處轉移和TNM分期早的胃癌患者RASSF1基因啟動子甲基化率低于分化程度低、有淋巴結轉移、有遠處轉移和TNM分期晚的患者，具體結果見表2。

表2 RASSF1基因啟動子甲基化與臨床病理因素的關系

3 討 論

RASSF1基因是從3號染色體短臂克隆獲得的抑癌基因，所編碼的RASSF1蛋白具有促進細胞凋亡的生物學效應，與腫瘤的發病機制密切相關。當RASSF1表達異常時，失去對細胞周期的調控，導致正常細胞發生無限制的增殖而出現癌變。已有研究發現，RASSF1蛋白在消化道腫瘤的診斷及患者病情判斷、預后評估中具有分子標志物作用［4－6］。研究證實，胃癌組織RASSF1表達水平顯著低于健康者正常組織，且其表達水平與胃癌臨床病理因素緊密相關。杜鴻等［3］采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT－PCR）檢測了胃癌患者RASSF1基因mRNA表達，發現其在胃癌組織中的表達缺失率顯著高于癌旁組織和正常胃黏膜組織，且其表達水平與胃癌TNM分期、浸潤深度和淋巴結轉移具有一定的相關性。葉梅等［7］檢測了胃癌組織RASSF1基因mRNA和蛋白質表達水平，結果證實胃癌組織RASSF1A基因mRNA和蛋白表達水平明顯低于癌旁正常組織，免疫組織化學檢測結果顯示RASSF1A在所有癌旁正常組織中的表達均為陽性，而在胃癌組織中的表達則明顯減弱或缺失，同時也發現RASSF1AmRNA及蛋白表達水平與胃癌分期顯著相關。上述研究報道均說明RASSF11基因表達缺失與胃癌的發病機制密切相關，同時說明其在胃癌診斷及患者病情判斷、預后評估方面具有較大的臨床價值，但目前對RASSF1基因表達缺失導致組織癌變的具體作用機制尚無相關研究。

表觀遺傳學是基因的核苷酸序列不發生改變時，非基因序列改變所導致的基因表達改變的生命現象，主要包括基因DNA甲基化和組蛋白乙酰化等調控機制。DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶作用下，基因組5′CpG二核苷酸胞嘧啶共價結合1個甲基基團，形成甲基化CpG（mCpG）。mCpG與DNA甲基結合蛋白（MBP）結合或直接阻礙轉錄因子與DNA啟動子序列結合，間接抑制基因表達［8－9］。DNA啟動子甲基化除基因突變外最為主要的腫瘤發病機制，甲基化水平可準確反映腫瘤患者病情及預后，較傳統的蛋白質水平生物標志物具有更高的靈敏度和特異度［10－12］。基于表觀遺傳學與基因表達的關系，以及胃癌組織中RASSF1基因表達下降的事實，可以認為RASSF1基因表觀遺傳學改變可能是導致其mRNA和蛋白表達異常的首要原因。本研究采用MSP技術對胃癌患者和健康者胃組織標本RASSF1基因啟動子甲基化進行了檢測，結果發現胃癌患者癌組織標本RASSF1基因啟動子甲基化率為62.7%，癌旁組織為4.0%，健康者正常胃組織甲基化率為2.7%，癌組織RASSF1基因啟動子甲基化率高于癌旁組織和正常胃組織（P＜0.05），證實胃癌RASSF1基因啟動子甲基化與其表達水平的降低密切相關，RASSF1基因啟動子甲基化導致其基因表達水平下降，從而導致RASSF1表達異常，失去對細胞周期的正常調控，導致正常胃細胞發生無限制增殖而癌變，最終出現胃癌表型。本研究同樣間接證實可將逆轉RASSF1基因啟動子甲基化用于胃癌患者的臨床治療。

本研究比較了胃癌患者癌組織RASSF1基因啟動子甲基化與臨床病理因素的關系，發現RASSF1基因啟動子甲基化率在不同性別、年齡、病變部位及HP感染患者間的比較差異無統計學意義（P＞0.05），在不同分化程度、腫瘤最大徑、淋巴結轉移、遠處轉移和TNM分期患者間的比較差異均有統計學意義（P＜0.05），腫瘤分化程度越低、最大徑越大、有淋巴結轉移、遠處轉移和腫瘤分期晚的患者，其RASSF1基因啟動子甲基化率越高，表明RASSF1基因啟動子甲基化與胃癌患者的病情和預后密切相關，與RASSF1基因mRNA和蛋白質表達在胃癌患者病情判斷及預后評估中的作用一致，間接證實基因表達合乎基因法則，均可作為胃癌患者病情判斷及預后評估的分子標志物。與手術切除標本對比，胃鏡活檢組織RASSF1基因啟動子甲基化檢測可在術前提供準確的病情判斷和預后評估依據，具有更為廣泛的臨床應用價值。

胃癌的發病機制主要與基因表達異常有關。目前的研究發現，環境等因素作用于機體后可導致基因表達異常，其中基因突變是最早被發現的，也是最經典的胃癌發病機制［13－14］。然而，有研究發現，某些胃癌患者的基因并不存在明顯的突變，但存在基因表達的異常，進一步的研究發現，不依賴于基因堿基序列改變的表觀遺傳學在胃癌的發病機制中扮演重要角色，先天性或后天性作用因素均可導致胃癌相關基因發生表觀遺傳學改變，包括基因啟動子甲基化和乙酰化改變，最終導致相關基因不能正常結合轉錄因子，從而抑制基因表達，最終產生胃癌表型［15－16］。目前發現的與胃癌相關的基因包括TIMP3基因［17］、上皮型鈣黏附素［18］、WRN 基因［19］和 BNIP3基因［20］等。隨著研究的逐漸深入，相信越來越多的基因表觀遺傳學作用機制將被發現參與了胃癌的發生、發展及轉歸。目前的研究發現，與基因突變不同，基因啟動子甲基化可被藥物逆轉從而使基因重新表達，因而具有潛在的臨床治療價值。5－氮雜－2′－脫氧胞苷是目前廣泛報道的用于逆轉基因啟動子甲基化的藥物［21］。體外試驗表明，5－氮雜－2′－脫氧胞苷具有去甲基化作用，能逆轉多種抑癌基因啟動子甲基化狀態，使其恢復表達，進而恢復抑癌功能，并在多種腫瘤細胞株中得到證實［22－23］。盡管體外試驗證實5－氮雜－2′－脫氧胞苷具有抑制甲基轉移酶，從而逆轉基因啟動子甲基化的作用，但目前尚無相關體內試驗研究的證實，因此5－氮雜－2′－脫氧胞苷的臨床應用尚存在給藥困難及尚未得到體內試驗研究證實等問題，極大地限制了其在臨床中的廣泛應用。然而，隨著分子生物學技術的發展，逆轉基因啟動子甲基化在非基因突變所致腫瘤中的應用終將成為現實。

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