茄子SSR遺傳多樣性及其農藝性狀的關聯分析

馮英娜， 柳李旺， 劉衛東， 王 倩， 崔群香

(1.南京農業大學，江蘇 南京 210095;2.金陵科技學院，江蘇 南京 211169)

茄子(Solanum melongenaL.)亦稱落酥、昆侖瓜，是茄科(Solanaceae)茄屬作物，染色體為2n=24，屬于漿果。茄子起源于東南亞熱帶地區。中國栽培茄子歷史悠久，品種繁多，是世界上最大的茄子生產國和消費國。茄子的營養價值很高，含有豐富的蛋白質、糖、維生素和多種礦質元素。另外茄子還含有豐富的維生素P，為蔬菜中最高。茄子藥效顯著，具有清熱、解毒、活血、止痛、利尿、消腫、降低膽固醇等功效［1］。

SSR(Simple sequence repeats)，又稱為微衛星DNA(Microsatellite DNA)，是以聚合酶鏈式反應PCR(Polymerase chain reaction)為基礎的標記。SSR標記是眾多分子標記技術中一種較好的方法，它具有共顯性、操作簡便、重復性好且廣泛分布于全基因組等優點［2-8］。目前SSR廣泛應用于植物的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構建、群體結構分析、基因定位及關聯分析等多方面的相關研究［9-10］，而在茄子上SSR標記發展相對滯后，目前僅見少量的被應用于群體結構分析和基因定位［11-12］。

關聯分析是以自然群體為材料，能夠檢測群體內處于連鎖不平衡狀態的標記或候選基因的遺傳變異與特定表型顯著關聯的頻率［13-14］。與連鎖分析方法相比，此方法具有三方面優點:①花費時間少，一般以現有的自然群體為材料，無需構建專門作圖群體;②可以同時檢測同一座位的多個等位基因;③作圖精度高。關聯分析的方法最早用在人類遺傳學，用來挖掘人類的致病基因，應用在植物上較晚。關聯分析方法目前主要用于小麥、水稻、棉花、大麥、大豆等經濟作物［15-17］。在茄子方面還未見報道。本研究對全基因組進行掃描，目的在于初步了解茄子材料的連鎖不平衡現象，本試驗采用SSR標記對國內外70個茄子材料進行遺傳多樣性分析、群體結構分析和關聯分析，旨在為茄子的親本選擇提供依據，同時通過分子標記與性狀關聯分析，進一步探討與形態和品質性狀相關聯的分子標記位點，為茄子的分子育種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗70份國內外茄子材料，于2013年1月份在玻璃溫室進行育苗，2013年4月7日定植于金陵科技學院幕府校區園藝實驗站塑料大棚內，茄子田間形態調查參照李錫香等［18］方法。2013年5～6月份測定茄子的各個品質指標。各材料及來源詳見表1。

1.2 SSR引物分析

本試驗選自的引物來自 Vilanova等［19］和 Zhu等［20］。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選出具有多態性的SSR引物54對，由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成。2013年3月5日取新鮮植株的葉片，采用簡化CTAB法進行DNA提取。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。PCR總反應體系為10.0μl，包括1 × Buffer 1.0 μl，Mg2+0.8 μl，dNTP 0.2 μl，TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)0.1 μl，正、反向引物各0.5 μl，ddH2O 5.9μl，DNA模板1.0μl。PCR程序為95℃ 2 min，94 ℃ 40 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 1min，32 個循環;最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR擴增產物在6%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染顯色拍照［21］。

1.3 數據統計分析

采用人工讀膠的方法，有帶的讀1，無帶的讀0，不確定的記為-9.以NTSYS-pc Ver.2.10計算遺傳相似系數(Genetic similarity，GS)并按非加權配對法(UPGMA)和SHAN程序聚類分析。基因頻率和Shannon指數通過Popgene32進行統計分析。以Structure 2.3.4軟件［22］進行群體遺傳結構的分析，估計最佳群體組群數K，其取值范圍為1～10，將MCMC(Markov chain monte carlo)開始時的不作數迭代(Length of burn-in period)設為100 000次，再將不作數迭代后的MCMC設為100 000次，迭代次數(Number of iterations)設置為5，計算Q參數，將其作為協變量。采用 TASSEL 2.0［23］中的 GLM(General linearmodel)模型結合分子標記數據、群體結構數據和表型性狀數據進行標記-性狀的關聯分析，確定關聯位點［24］。

2 結果

2.1 分子標記多態性分析

從供試材料中選擇6個表型差異大的材料對68對SSR引物進行篩選，從中選出擴增條帶清晰，重復性好，多態性豐富的SSR引物18對，共檢測到130個等位變異，平均每個引物7.2個等位變異，變化范圍2～9個等位變異。等位變異最多的標記為CSM44(圖1)，共檢測到9個等位變異，其次是CSM40，檢測到7個等位變異。基因多樣性指數和Shannon指數變幅分別為0.070 0～0.404 4和0.103 6～0.584 8，平均值分別為0.181和0.263。大多數材料的遺傳相似系數分布在0.61至0.82之間，這表明不同茄子材料之間有一定差異，但差異不大，遺傳背景較窄。

2.2 聚類分析

利用18對SSR引物對茄子材料進行鑒定，對數據進行聚類分析，結果(圖2)顯示，在相似系數0.61處將70份材料分為6大類。第1類包含3個材料，果萼色都為綠色。第2類包含36個材料，在相似系數0.64處可進一步分為2個亞類，第1亞類主要是長茄，包括9份國內長茄、2份荷蘭長茄、1份日本長茄、3份國內圓茄和1份日本圓茄。第2亞類主要以紫茄為主，14份國內紫茄、4份日本紫茄、2份國內綠茄。第3類包括19份材料，在相似系數0.6處又可分為2個亞類，第1亞類只有45號果色為白色，其他均為紫色或者是紫黑。第2亞類均為紫色，主要以國內茄為主，12份國內茄、1份菲律賓茄、1份日本茄。第4類主要是長茄，果萼色均為綠紫。第5類為62號扁紅茄，來自于非洲，果色橘紅色，野生種。第6類是果萼色為綠紫，果色都是鮮紫。

2.3 群體遺傳結構分析

為了消除關聯分析時由于供試材料群體結構引起的偽關聯，根據Evanno等［25］的方法，利用18對引物對70個供試材料進行群體結構檢測，結果顯示該群體可分為5個亞群，分別為POP1、POP2、POP3、POP4和POP5。根據每個亞類群中主要顏色所占的比例(Q值)，將Q＞0.6視為血緣單一，Q＜0.6視為具有混合來源［26］，分析不同基因型個體在相應亞類群中的遺傳背景(圖3)。結果顯示，各亞類群間存在明顯的差異。POP1亞類群(紅色)包括16份材料，主要以紫色茄為主，各部分材料Q值均大于0.6，表明種質來源單一，遺傳背景不復雜，同其他類群缺少基因交流。POP2亞類群(綠色)由29份材料組成，果萼色以綠紫為主，有8份材料Q值都在0.6以下，表明其具有混合來源，遺傳背景較復雜，如傾國69含有較多的POP1遺傳背景，主力長茄品種含有較多的POP5遺傳背景。萬壽龍品種含有較多的POP4、POP5遺傳背景。POP3亞類群(藍色)，由15份材料構成，以長筒茄為主。其中有8份材料遺傳背景復雜，按Q值從大到小依次為西方神茄、麗華、艷麗長、尼爾、扁紅茄、美引茄冠、蘇崎茄、紫塔號;從外形來看，果形、果萼色不同，基因交流較頻繁。POP4亞類群(黃色)，由7份國內長茄組成，其中4份材料來源于西南地區，其混合來源單一。POP5亞類群(淺紫色)，包括3份材料，果色為黑紫色。

圖2 SSR標記的70份材料的UPGMA聚類圖Fig.2 Dendrogram of 70 eggplant varieties analyzed by SSR-UPGMA based on genetic similarities

2.4 SSR標記與農藝性狀的關聯分析

本研究檢測的18對SSR引物，有13對引物的17個位點與測試性狀相關聯。結果(表2)顯示，其中與葉柄長相關聯的位點有5個，與單果質量、可溶性蛋白質、蘆丁、果色、果萼色5個性狀顯著關聯的位點各3個，與株型、首花節位、可溶性糖3個性狀顯著關聯的位點各有2個，其余的性狀顯著關聯的位點只有1個。其中位點CSM44-1是關聯性狀最多的位點，與首花節位、果形、單果質量、葉柄長4個性狀相關聯，對4個性狀的變異解釋率分別為46.0%、50.1%、47.5%、42.3%。位點CSM33-5、CSM65-3是關聯性狀最少的位點，分別與株高、可溶性固形物關聯，對其變異解釋率分別為21.1%、24.7%。位點CSM40-6、CSM47-2、CSM71-6分別與蘆丁、葉柄長、果萼色極顯著相關(P＜0.01)，其變異解釋率分別達到43.2%、29.8%、26.5%。

分析結果發現，同一個位點與多個性狀相關聯和多個位點與同一性狀相關聯的情況很普遍。原因可能是蔬菜的許多重要的農藝性狀均屬于由多個基因控制的數量性狀。

3 討論

3.1 茄子遺傳多樣性和群體結構分析

分子標記是鑒定茄子材料親緣關系有效途徑之一。本研究用SSR對70份茄子材料遺傳多樣性分析，在一定程度上反應了70份材料直接的親緣關系，聚類分析的遺傳相似系數大多數在0.56～0.93，平均相似系數在0.68，在分子水平上遺傳差異不大，這與前人的研究結果一致［12，27］。在茄子的育種過程中，育種工作者應繼續努力拓寬茄子的遺傳基礎，解決遺傳背景狹窄問題，為茄子品種選育提供豐富的親本。

將群體結構所得的Q值作為協變量代入回歸分析。以消除供試材料群體結構的偽關聯，確保關聯分析的準確性［28-29］。本研究基于SSR標記，利用Structure2.3.4軟件的群體結構分析將70個材料分為5個亞類群。其中POP1亞類群主要是國內茄，只有4份國外茄子材料，可能是頻繁的商業化導致基因之間的交流。表明茄子群體結構的劃分與來源有一定的關系。這和肖熙歐等［30］、孫源文等［31］的研究比較吻合。POP2亞類群主要是紫茄(紫黑、鮮紫、紫紅)。扁圓茄、圓球茄、高圓茄分布在POP1、POP2、POP3、POP5亞類群中，可能是沒有篩選到合適的引物將他們分在一起。長條茄、長羊角茄、長筒茄主要分布在POP1、POP2、POP3 3個亞類群，這與傳統的Bailey［32］茄子分類相符。本試驗部分材料是國外引進的品種，但和中國的材料遺傳系數較高，可能是育種工作者的育種目標相同，導致遺傳背景相似。其次利用SSR標記進行群體結構分析，必須要有足夠的多態性位點能覆蓋較全的基因組，才能提高群體結構的準確性，但同其他標記相比，SSR引物產生的多態性較低，且研究中所使用SSR數目有限，使得結果可能產生誤差。

表2 與農藝相關性狀顯著關聯的SSR位點Table 2 SSR loci significantly associated with agronom ic traits in eggplant

3.2 茄子SSR分子標記的關聯分析

關聯分析(Association analysis)，又稱關聯作圖(Association mapping)，首次將關聯分析用于植物上的是Hansen等［33］對野生甜菜生長習性的研究。其發現在17個引物組合擴增的440個全基因組范圍內的AFLP引物中，有2個位點與控制抽薹前是否需要春化的B基因顯著關聯。目前關聯分析在作物方面主要用在小麥、玉米、水稻、棉花等。印志同等［34］采用71對SSR引物掃描85份糯玉米自交系材料進行耐鹽性鑒定，共檢測到9個標記位點分別與5個耐鹽性狀顯著關聯，其中1個位點同時與2個性狀存在顯著關聯。王艷平等［35］用45份材料構成的品種群體對38個特異性、一致性、穩定性(DUS)測試性狀與45個分子標記進行關聯分析，結果表明，20個分子標記位點與23個DUS測試性狀相關聯。本研究在18對引物上共檢測13對引物的17個位點與茄子的14個數量性狀相關聯(P＜0.05)。其中位點CSM21-4、CSM47-3、CSM63-5與果色顯著相關，變異解釋率分別為28.4%、19.2%、26.7%。

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