草魚不同混養系統中細菌生產力的初步研究*

李 博，田相利，王 芳，董雙林，張永勝

（中國海洋大學海水養殖教育部重點實驗室，山東，青島266003）

細菌是水產養殖生態系統中極為重要的組成部分，它們既是分解者，又是生產者，在微食物環及養殖生態系統的物質流動和能量循環中發揮著十分重要的作用，引起越來越多學者的重視［1］。細菌分解利用生物營養轉化中遺失在水體中的溶解性有機物（DOM）和顆粒性有機物（POM），合成自身顆粒有機物的過程，稱為細菌的生產力或二次生產力［2］。與天然水域相比，養殖池塘生態系統中由于大量投餌，細菌生產力更大［3］。已有研究表明，水體中的細菌是濾食性魚類生長發育所需蛋白質的重要來源之一，盡管大多數浮游細菌難以被直接利用，但濾食性魚類可以濾食細菌總數的10%～20%作為食物［3］。因此，了解池塘養殖系統細菌的生產力狀況有助于評價養殖系統的運轉情況以及池塘生態系統結構與功能狀況。

迄今為止，有關淡水池塘細菌生產力的研究還不多見［3－4］，而關于草魚（Ctenopharyngodon idellus）混養模式細菌生產力的研究則尚未見報道。為評價草魚混養生態系統細菌生產力狀況，本研究利用陸基實驗圍隔，采用原位實驗生態學方法，對比研究了5種草魚混養模式生態系統的細菌生產力，并采用主成分分析（PCA）的方法探討了細菌生產力與浮游植物初級生產力以及主要水質環境因子的關系，以期為草魚不同混養模式的結構優化、草魚混養生態系統健康的維護和池塘的管理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗圍隔

實驗所用陸基實驗圍隔設置于山東省淡水水產研究所池塘內。池塘面積為0.3hm2、平均水深1.5m左右，圍隔規格為7m×7m。具體結構參見李德尚等［5］。

1.2 實驗設計與管理

1.2.1 實驗設計 本研究設計了5種不同的以草魚為主的混養模式，分別為草魚與鯉魚（Cyprinus carpio）和鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）按不同的比例混養。具體為：草魚和鰱魚混養（GS）、草魚和鯉魚混養（GC）、草魚與鰱魚和鯉魚混養（GCS1和GSC2），其中GSC1和GSC2 2個實驗組3種魚的放養比例不同，以草魚單養（G）為對照組。每個實驗組分別設置了3個重復，共使用了15個實驗圍隔。各處理具體的放養和收獲情況見表1。

表1 不同草魚混養模式的放養和收獲情況Table 1 Stocking and harvest information in the experimental enclosures

1.2.2 實驗管理 每個圍隔設置充氣石2個，通過PV管與岸邊充氣泵連通，連續充氧。每天分別于08：00、10：00、13：00和16：00投喂“海大牌”草魚膨化配合飼料（福建海大飼料有限公司，漳州），日投餌量為草魚生物量的2%～3%，根據草魚生長情況及時改變投喂量。實驗期間不換水。實驗時間從2011年5月19日～10月19日。

1.3 細菌生產力的測定

取實驗圍隔中層（0.4～0.5m水層）水樣，經3μm核孔濾膜過濾（目的是排除攝食細菌的浮游動物并使細菌所受傷害程度最小）后，濾液按50mg／L濃度加入放線菌酮，殺死真核生物，之后將濾液置于250mL的經過酸洗、滅菌的玻璃瓶內，在圍隔原位掛瓶培養24h后，測定培養前后瓶內細菌的現存量［6－7］。細菌生產量計算參照Fuhrman等［8］方法，由原位培養期間實驗瓶內細菌細胞數目的增量得出。細菌細胞體積對生物量的轉換系數取5.6×10－13g C／μm3［9］。

細菌數量的測定采用吖啶橙熒光顯微鏡直接計數法（AODC法）［10］。具體方法為：取定量的細菌水樣，滴加0.1%的吖啶橙染色3min，將染色后的水樣用孔徑為0.2μm、直徑為25mm 的核孔濾膜（Whatman nuclepore track－Etch membrane）過濾，然后用無顆粒水沖洗濾器3次，每次3～5mL。將沖洗后的濾膜置于載玻片上，滴加一滴無自發熒光的顯微鏡油，加蓋玻片，用鑷子輕壓。用落射光熒光顯微鏡（光源為200W汞燈，激發光濾片為450～490nm，光束分離濾光片為510nm，阻擋濾光片為520nm）計數視野中的菌體。一般隨機選取10個視野，每個視野菌數以30個左右為宜。

1.4 其它環境因子的測定

在細菌的生產力的測定過程中，同時對各實驗圍隔水體的水溫、透明度、無機氮（DIN）含量、磷酸鹽含量、溶解有機碳（DOC）含量、顆粒有機碳（POC）含量以及浮游植物初級生產力等環境因子進行測定。其中，透明度、無機氮、磷酸鹽的具體測定方法參照《海洋監測規范》（GB17378－2007）［11］進行，溶解有機碳（DOC）含量以總有機碳分析儀（TOC－5000A，日本島津公司）測定，顆粒有機碳（POC）的含量以元素分析儀（Vario ELⅢ，德國Elementar公司）測定。

1.5 數據分析

所有實驗數據均以平均值±標準差（mean±SD）表示，實驗所得數據用SPSS 18.0統計軟件進行處理，以P＜0.05作為差異顯著水平。

2 結果

2.1 水質理化指標

2.1.1 水體溫度、透明度、無機氮和磷酸鹽 整個實驗期間，水溫變化于19.8～29.2℃之間；不同實驗處理組透明度的變化的規律不明顯，總體呈逐月下降趨勢；無機氮含量變化在（0.43±0.11）～（1.34±0.03）mg／L之間，5～8月份，無機氮含量逐漸升高，在8月達到最大值后逐漸下降，10月份又略有上升，除5和8月份無機氮含量在5個處理組之間無顯著差異之外，其他幾個月份，各處理組差異顯著（P＜0.05）；磷酸鹽含量變化在（0.67±0.16）～（81.33±5.21）μg／L之間，各處理組磷酸鹽的含量多以5月份為最高。6月份，G處理組和GS處理組之間無顯著差異，但均顯著高于其他3個處理組（P＜0.05），7月份，G處理組顯著高于GC處理組（P＜0.05），其他3個處理組之間無顯著差異，但均顯著低于 GC處理組（P＜0.05），8月份，GSC2處理組顯著高于其他處理組（P＜0.05），但其他各處理組之間差異不顯著，9月份，G處理組和GSC1處理組之間差異不顯著，但顯著高于其他3個處理組（P＜0.05），10月份，各處理組之間差異不顯著。具體狀況見表2。

2.1.2 DOC和POC含量 實驗期間各處理組水體DOC含量變動情況見表3。5個實驗處理組DOC的變化在（2.59±0.94）～（5.95±0.19）mg／L之間，平均為（4.19±0.92）mg／L。實驗期間，不同時間各處理 DOC數值有所差異。其中，GSC1處理組6月份DOC含量顯著高于其它處理組（P＜0.05），而GSC2與GS和GC處理組無顯著差異，但顯著高于G處理組（P＜0.05）；7月份，GSC1與GSC2處理組無顯著差異（P＞0.05），但顯著高于其它3個處理組（P＜0.05）；8月份，GSC1、GSC2和GS處理組之間無顯著差異（P＞0.05），但明顯高于其它2個處理組（P＜0.05）；9月份和10月份，GS和GC處理組DOC含量略高于G組，略低于GSC1和GSC2處理組，但與二者均差異不顯著（P＞0.05）。

表2 實驗期間水體溫度、透明度、無機氮和磷酸鹽狀況Table 2 Water temperature，transparency and concentration of DIN，phosphate in the experimental enclosures

表3 實驗圍隔DOC含量Table 3 Concentration of DOC in the experimental enclosures ／mg·L－1

實驗期間各處理POC含量見表4。各處理組POC的變化在（2.40±0.24）～（10.21±2.65）mg／L之間，平均為（4.67±2.41）mg／L。實驗期間，不同時間各處理POC數值有所差異。其中，6月份，GSC2處理組POC含量最高，顯著高于其它處理組（P＜0.05），GS處理組POC含量顯著高于G處理組和GC處理組（P＜0.05）；7和8月份，GSC1處理組和GSC2處理組POC含量顯著高于其它3個處理組（P＜0.05）；9月份各處理組無明顯差異；10月份。GC和GSC2處理組POC含量略高于G和GS處理組，低于GSC1處理組，但與二者差異均不顯著（P＞0.05）。

2.2 浮游植物初級生產力

實驗期間各實驗處理組浮游植物的初級生產力見表5。可以看出，實驗期間各處理組浮游植物初級生產力變動于（0.69±0.13）～（4.03±0.49）mg C·L－1·d－1，平均為（2.28±1.0 2）mg C·L－1·d－1。其中，GSC1和GSC2組浮游植物初級生產力顯著高于其它處理組（P＜0.05）。各處理組浮游植物初級生產力均呈現出先上升，后下降的趨勢，且均在8月份達到最高值。不同時間各處理初級生產力有所差異。其中，6月份，GSC2處理組顯著低于GSC1處理組，顯著高于其它3個處理組（P＜0.05）；7～9月份，GSC1和GSC2處理組之間差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于GS處理組（P＜0.05），GS處理組則顯著高于G和GC處理組（P＜0.05）；10月份，GSC1和GSC2處理組則顯著高于G、GS和GC處理組（P＜0.05）。

表4 實驗圍隔POC含量Table 4 Concentration of POC in the experimental enclosures ／mg·L－1

表5 實驗圍隔浮游植物的初級生產力Table 5 Phytoplankton productivity in the experimental enclosures ／mg C·L－1·d－1

2.3 細菌數量和生產力

實驗期間各處理組細菌的數量變動情況見表6。實驗期間，各實驗處理組細菌數量波動在（0.76±0.03）～（9.27±0.22）×106個／mL，平均為 （2.15±0.10）×106個／mL。實驗期間，不同時間各處理水體細菌數量有所差異。其中，6月份，以GC處理組為最高，顯著高于其它處理（P＜0.05）；7月份，以G組數量最高，GSC1處理組數量最低，各處理差異顯著；8月份，GSC1處理組最高，顯著高于其它處理組（P＜0.05）；9月份，GSC1處理組數量最高，顯著高于G和GS處理組（P＜0.05）；10月份，G 處理組明顯高于其它處理 （P＜0.05），GSC1和GSC2處理組則顯著要高于GC和GS處理組（P＜0.05）。

實驗期間各處理組細菌的生產力見表7。可以看出，整個實驗期間，各處理組細菌的生產力波動在（85.22±9.68）～（899.24±29.67）μg C·L－1·d－1，平均為（442.33±210.51）μg C·L－1·d－1。5個處理組細菌生產力總體上均呈現先升高，后降低的趨勢，在8月份達到最高值。6和7月份，GSC1處理組顯著高于GSC2處理組，顯著高于其他3個處理組；8～10月份，GSC1處理組顯著高于GSC2處理組，GSC2處理組顯著高于GS和GC處理組，G處理組細菌生產力最低。

表6 實驗圍隔的細菌數量Table 6 The number of bacterium in the experimental enclosures ／106個·mL－1

整個實驗期間，各實驗處理組細菌生產力與浮游植物初級生產力的比值平均為0.20。

表7 實驗圍隔細菌的生產力Table 7 Bacterial productivity in the experimental enclosures ／μg C·L－1·d－1

2.4 細菌生產力與主要水質環境因子的關系

對主要水質環境因子對細菌生產力進行了主成分分析，所得結果見表8。

使用全部水質環境因子進行PCA分析，提取出6個主成分（F1～F6）。其中，主成分F1～F4的累積貢獻率均達到了90%以上，詳見表8。養殖前期（以6月份為代表），主成分F1由無機氮、DOC、POC組成，其貢獻率高達44.06%，F2由水溫、透明度組成；養殖中期（以8月份為代表），主成分F1由DOC、POC組成，其貢獻率降為32.69%，與F2、F3的貢獻率差距不大，F2由磷酸鹽、無機氮組成；養殖后期（以10月份為代表），主成分F1由無機氮、DOC、POC組成，其貢獻率又上升為45.92%，明顯高于其他主成分，其中 DIN、PO4－P、DOC和POC的載荷均較大，F2由水溫組成。

提取主成分F1、F2作圖（見圖1）。將各處理組主成分F1的得分系數進行方差分析顯示，養殖前期與中期，GSC1和GSC2處理組與其它處理組在F1、F2 2個主成分上均差異顯著（P＜0.05）；養殖后期，GSC1和GSC2處理組在主成分F1上差異顯著，但在主成分F2上，各處理組無顯著差異。

相關分析表明，水體細菌的生產力（BP）與浮游植物的初級生產力（PP）、DOC含量（CDOC）、POC含量（CPOC）及水溫（T）均呈顯著正相關，與水體磷酸鹽含量（CPO4－P）呈顯著負相關，回歸方程分別為：

細菌與水體中無機氮含量也呈現正相關，但不顯著。與水體透明度不具有相關性。

表8 PCA分析的主要結果Table 8 Main results of PCA

圖1 不同混養模式主要水質環境因子的主成分分析Fig.1 PCA of main factors of water quality in the experimental enclosures

3 討論

3.1 不同混養模式細菌的生產力

草魚一般喜棲于水體中下層，為典型的草食性魚類；鯉魚屬于雜食性底棲魚類，常拱泥攝食；鰱魚則屬中上層的典型的濾食性魚類。以往的研究表明，將三者混養在一起，可充分利用其生態習性的互補性，不僅可充分利用水體的空間，有效提高養殖動物的產量，也可顯著提高對系統的物質利用率［12］。從本研究結果則可以看出，不同混養動物的生態習性存在的差異以及對生態系統產生的不同混養效應也同樣對細菌的生產力產生較大影響，不同處理細菌生產力有所差異。其中，草魚、鰱魚和鯉魚三元混養模式具有較高的細菌生產力，顯著高于二元混養和草魚單養組。推測這可能與三元混養模式形成的良性的生態系統具有良好的穩定性和可調節性有關。在養殖系統里，細菌同時具有多種不同的生態功能。它不僅是池塘生態系統的分解者，也是重要的生產者之一，還可以作為餌料直接被濾食性動物所濾食和利用［1］。而細菌生產力則受系統內基質的濃度、可利用性及環境中理化、生物因子等多種因素的影響，變化也比較大［13］。本研究發現，水體中細菌的生產力與水溫、浮游植物的初級生產力、DOC含量、POC含量均呈顯著正相關，與水體磷酸鹽含量呈顯著負相關。而在多元混養系統里，遺留在水中的飼料和魚類代謝排出的廢物，為細菌的生長和繁殖提供了豐富的營養物質，而混養的鰱魚對細菌的攝食，也對細菌的生長繁殖產生有效的刺激，此消耗－刺激過程最終在多元混養這一穩定的生態系統內達到動態平衡［14］，并使細菌的生產力在較高的水平上達到相對穩定，從而不僅有助于維持系統的良性運轉，還可以有效提高系統內物質和能量傳遞和利用。不過，由于涉及的因素眾多，其內在的深層次機理尚待進一步研究。

3.2 細菌的生產力與主要水質環境因子的關系

細菌是典型的基質限制性（Substrate－limited）生物，個體微小，繁殖死亡速率都很快，對水體理化、生物因子應答快速，其生物量及生產力變化較大，變動過程也比較復雜［15］。

溫度是影響細菌生長的最主要因素之一。在一定的溫度范圍內，細菌體內酶的活性隨溫度的升高而升高，而細菌的新陳代謝主要取決于其體內酶的活性［16］。因此，實驗過程中，細菌的生產力隨著水溫的升高而升高。同時，由于水溫的升高，顯著影響了浮游植物的初級生產力，導致環境中DOC等有機物的含量升高，為細菌的生長繁殖提供了大量的營養物質，從而間接影響細菌的生產力。

本研究中細菌生產力與浮游植物初級生產力呈現出顯著相關性，說明二者在營養上的偶聯關系［17］。浮游植物初級生產力越高，釋放出的各種營養物質也越高，提供給細菌利用的有效基質也越豐富，而異養細菌主要利用浮游植物生產釋放的溶解有機物，以及浮游動物對浮游植物攝食過程中溶出的溶解有機物作為碳源進行生長和增殖［18－20］，故細菌的生產力隨著浮游植物初級生產力的升高而升高。本研究得出細菌的生產力占浮游植物初級生產力的12%～26%，平均約為20%，低于高村等［21］對淡水魚池（31%～39%）和 Morris等［22］對湖泊（60%～66%）的測定結果（采用的是甲基胸腺嘧啶脫氧核苷示蹤法）［23］，這可能與研究方法不同有關。據Fuhrman等［24］報道，甲基胸腺嘧啶脫氧核苷示蹤法研究細菌生產量結果明顯高于排除浮游動物后水樣細菌數量增加法所得的細菌生產量。

水體中的溶解有機物（DOM）是異養浮游細菌維持復雜的生命活動、進行生長和繁殖最基本的營養要素。DOM由上千種有機物組成，成分極為復雜，包括有機酸類、糖類、氨基酸、多肽、蛋白質、脂類、核酸和磷脂等。根據來源不同，DOM可分為2類，外源性和內源性。外源性DOM主要來自降水、地面徑流和地下水輸入，因受人為影響大，成分尤其復雜易變；而內源性DOM的主要來源包括：①浮游植物以溶解方式的釋放［25］；②浮游動物攝食活動中的釋放；③水體中的POM通過細菌釋放胞外酶而降解；④細菌自身的釋放。內源性DOM的可利用性遠遠大于外源性DOM。溶解性有機碳（DOC）既具可溶性又具有可降解性，易被細菌降解利用，周轉速度快，是水體中的碳從浮游植物流動到異養細菌生產量這一過程中最為活躍、最為關鍵的物質之一［1］。一般認為，浮游細菌通常受碳源（C）限制。例如，梅志平和施正峰研究表明，高產魚池中細菌生長的C供應不足，可限制細菌的生長［26］。本研究發現，隨著時間增加，投餌量的積累，溫度升高，浮游植物的釋放，DOC含量呈現出先上升后下降的趨勢，而細菌的生產力隨DOC含量的升高而升高，降低而降低，具有極為顯著的相關性，充分顯示了有機營養物質的供應對細菌生長繁殖的重要影響。同時，水體中較高的POC含量促使細菌釋放更多的胞外酶，分解成更多可利用的DOC，故細菌的生產力與POC含量也呈現出明顯的正相關性。

本研究發現，各混養處理水體細菌生產力與水溫、初級生產力、DOC含量、POC含量均呈顯著正相關，但與水體磷酸鹽含量呈顯著負相關。本研究進一步使用水質環境因子進行了PCA分析，除5月份以外，提取出6個主成分（F1～F6），其中主成分F1～F4的累積貢獻率均達到了90%以上。可以看出，不同時間環境因子對水體細菌生產力影響差異較大。在養殖前期（以6月份為代表），主成分F1由無機氮、DOC和POC組成，其貢獻率高達44.058%，說明N、C為養殖初期細菌生產力的關鍵調控元素；在養殖中期（以8月份為代表），主成分F1（DOC、POC）的貢獻率降為32.693%，與F2（磷酸鹽、無機氮）、F3（溫度）的貢獻率差距不大，說明細菌的生長對各種元素的需要趨于多樣性，DOC在F1中的載荷較高，其對細菌生產力的貢獻更為突出。由于PO4－P含量的降低，P元素匱乏，成為細菌生產力的限制因素；而在養殖后期（以10月份為代表），主成分F1的貢獻率又上升為45.921%，高于其他主成分，說明隨著溫度和各種營養元素含量的降低，溫度的限制作用顯著，而DIN、PO4－P、DOC和POC的載荷均較大，反映出營養鹽對細菌生產力的作用趨于平衡。上述分析可以看出，不同時期細菌生產力可能由不同因子驅動：養殖前期，DIN、DOC、POC是細菌生產力的關鍵因素；而DOC、POC的重要作用使得養殖中期細菌生產力處在較高水平，但PO4－P含量成為養殖中期細菌生產力的限制因素；而低溫限制了浮游植物的初級生產力，使得養殖后期較高的營養元素含量只能維持細菌較低的生產力。整個養殖期間，DOC的載荷均較高，說明DOC是影響細菌生產力的最重要的因素。

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