KRUPPLE樣轉(zhuǎn)錄因子6蛋白在口腔癌組織中的表達及其與P21蛋白的關(guān)系

劉圓月 侯菊花 李 燦

益陽醫(yī)學(xué)高等專學(xué)校病理教研室，湖南益陽 413000

Krupple樣轉(zhuǎn)錄因子6（KLF6）屬于一種核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能夠與靶基因啟動子區(qū)域的GC盒以及CACCC盒等核心元件進行特異性地結(jié)合，從而發(fā)揮生物效應(yīng)，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，具有抑制細胞生長以及殘余細胞衰老調(diào)控等功能[1-2]。P21基因是20世紀90年代發(fā)現(xiàn)對的一種全新的抑癌基因，可通過與Cyclin cdk復(fù)合物之間相結(jié)合對Rb蛋白的磷酸化過程起到一定的抑制作用，從而對細胞周期進行負調(diào)控[3]。本研究主要以口腔癌組織為研究對象，著重探討了KLF6蛋白在口腔癌中的表達及其與p21蛋白的關(guān)系，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2007年9月～2012年9月入住益陽醫(yī)學(xué)高等專學(xué)校附屬醫(yī)院的50例口腔癌組織、50例口腔癌旁組織及50例正常口腔組織作為研究對象。口腔癌患者中，男29例，女21例；年齡19～78歲，平均（50.20±11.38）歲；口腔癌旁組織均取自于本組患者；正常口腔患者中，男27例，女 23例；年齡20～74歲，平均（47.09±9.39）歲。 入選標準[4]：①經(jīng)病理學(xué)診斷為口腔癌；②術(shù)前患者均未進行放化療；③具有完整的臨床資料等。兩組患者均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準且經(jīng)患者本人知情同意入組。三組患者在性別、年齡等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

所有組織均使用10%的甲醛進行固定，使用石蠟進行包埋，4 μm厚連續(xù)進行切片，組織切片常規(guī)烤片、脫蠟、微波抗原修復(fù)以及清除內(nèi)源性過氧化物酶、DAB顯色，蘇木精襯染；使用已知陽性切片作為陽性對照，使用磷酸鹽緩沖液（PBS）來代替一抗作陰性對照。染色方法具體參考說明書進行操作[5]。

1.3 結(jié)果判定標準

KLF6陽性標記部位在細胞核和細胞漿；p21陽性標記部位主要在細胞核。采用雙盲法由2名經(jīng)驗豐富且不知道臨床資料的臨床病理專家分別獨立作出判斷：400倍視野隨機計數(shù)4個不同視野的陽性細胞數(shù)和細胞總數(shù)，計算陽性細胞占細胞總數(shù)的比值。參照Fromowit等的方法在高倍鏡下對著色反應(yīng)作評分：a.無著色為 0分，淡黃色為 1分，棕黃色為 2分，棕褐色為3分；b.陽性范圍：無著色為0分，＞0%～10%為1分，＞10%～50%為 2分，＞50%～80%為 3分；＞80%～100%為 4 分，兩項結(jié)果相乘，0～6 分為陰性（-），7～12分為陽性（+）[6]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計及分析，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗，相關(guān)性采用線性回歸分析的方法進行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KLF6及p21表達與口腔癌臨床病理因素的關(guān)系

由表1可知，KLF6及p21表達在浸潤深度方面，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但在年齡、性別、腫瘤大小、Dukes′分期及淋巴轉(zhuǎn)移等方面差異無統(tǒng)計學(xué)差異（P ＞ 0.05）。 見表1。

表1 Krupple樣轉(zhuǎn)錄因子6（KLF6）及 p21表達與口腔癌臨床病理因素的關(guān)系（n=50）

2.2 KLF6及p21蛋白在口腔癌、癌旁組織及正常口腔組織中的表達情況

由表2可知，KLF6及 p21蛋白陽性表達率大小為：口腔癌 ＞癌旁組織 ＞正常口腔組織，且兩種蛋白在上述三種組織中的陽性表達率相比，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.001）。見表2。p21、KLF6在口腔癌組織及口腔癌旁組織中的表達見圖1。

表2 Krupple樣轉(zhuǎn)錄因子6（KLF6）及 p21蛋白在口腔癌、癌旁組織及正常口腔組織中的表達（例）

圖1 p21、KLF6在口腔癌組織及口腔癌旁組織中的表達

2.3 KLF6與p21蛋白在口腔癌組織中的關(guān)系

由表3可知，口腔癌組織中KLF6與p21具有正相關(guān)性（r=0.568，P ＜ 0.01）。 見表3。

表3 Krupple樣轉(zhuǎn)錄因子6與p21蛋白在口腔癌組織中的關(guān)系（例）

3 討論

相關(guān)研究證實，絕大多數(shù)腫瘤細胞均存在著一些細胞周期調(diào)控因子的表達異常，哺乳動物分裂與分化的主要調(diào)節(jié)事件發(fā)生在G1期，而該時期周期蛋白會出現(xiàn)異常表達可能會引起細胞周期的失調(diào)，進而引起腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[7-8]。在這其中，腫瘤的發(fā)展受到多種基因的影響，其中KLF6基因等[9]。KLF6基因編碼蛋白由283個氨基酸所組成，即82個氨基酸的鋅指DNA結(jié)合區(qū)與氨基端的2012個氨基酸的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)所構(gòu)成。KLF6參與細胞的生長、繁殖、凋亡、血管生成以及組織損傷修復(fù)等過程，同時它在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮著十分重要的作用[10]。相關(guān)臨床研究表明：KLF6基因的失活與散發(fā)性口腔癌存在直接的關(guān)系，其機制可能與APC、K-RAS等基因的缺失存在一定的關(guān)聯(lián)性[11]。

有研究報道稱，KLF6與肝癌及前列腺癌的發(fā)生存在十分密切的關(guān)系[12]。該基因主要通過對腫瘤細胞的增殖產(chǎn)生的抑制以及促腫瘤細胞凋亡的作用，且其表達還與體內(nèi)NO的合成存在一定的關(guān)系，可使得細胞內(nèi)源性NO合成酶的mRNA的表達能力大大增加，有臨床研究表明，NO合成酶mRNA的表達速度會提高 4倍左右[9]。 同時，TGF-β1與 TGF-βⅠ、Ⅱ型受體以及誘生型NO合成酶等也是KLF6的靶基因。這些靶基因均能夠參與機體的細胞周期的調(diào)控以及細胞凋亡等過程之中，上述均說明了KLF6對腫瘤會產(chǎn)生抑制作用[13]。本研究結(jié)果表明，KLF6與口腔癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。口腔癌組織中KLF6的表達要明顯高于正常口腔組織與癌旁組織，且隨著細胞分化程度地逐漸降低，細胞增殖能力會逐漸增強以及細胞腫瘤化程度增加，此時，有大量異常的 KLF5會聚集在細胞漿之中，說明了細胞漿表達的KLF6能夠作為判定腫瘤惡性程度的一個重要指標[14]。

細胞生長控制是正常組織的一個十分重要的特點，如果細胞的生長控制能力喪失了，那么就會使得腫瘤細胞的生長與繁殖。調(diào)控細胞生長的一個非常關(guān)鍵的因子就是p21蛋白，它是一種細胞周期依賴性激酶抑制物，通過阻止Rb基因的磷酸化而對轉(zhuǎn)錄因子E2F的活性加以調(diào)節(jié)[4]。具體的調(diào)節(jié)過程為：當(dāng)Rb基因處于磷酸化狀態(tài)的時候，調(diào)節(jié)細胞周期進展的某些關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄不能被E2F激活[15-16]。因此，p21阻止了G1期向S期的過渡過程，將細胞周期阻止在二者之間，從而對細胞的生長產(chǎn)生抑制性作用。劉圓月等[16]推測p21基因的失活是口腔癌發(fā)生過程中的早期分子事件。

本研究觀察指標為：KLF6及p21蛋白在口腔癌、癌旁組織及正常口腔組織中的表達情況及KLF6與p21蛋白在口腔癌組織中的關(guān)系。結(jié)果表明：KLF6及p21蛋白陽性表達率大小為：口腔癌 ＞癌旁組織 ＞正常口腔組織，且兩種蛋白在上述三種組織中的陽性表達率相比，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；口腔癌組織中KLF6與p21具有正相關(guān)性（r=0.568，P＜0.01）。

綜上所述，KLF6與p21蛋白在口腔癌的發(fā)生與發(fā)展中可能具有非常重要的作用，且兩者在口腔癌組織中呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。

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