提高LIPOFECTAMINE2000對PC12細胞轉染效率的研究

邱 燁

浙江省湖州市南潯區中西醫結合醫院檢驗科，浙江湖州 313009

PC12細胞誘導產生的神經軸突能作為研究神經退行性疾病及脊柱損傷的研究模型[1-2]，也是研究神經內分泌試驗的模型[3]。細胞轉染技術是分子生物學及基因工程關鍵步驟之一[4]，也是體外研究神經細胞特定基因表達調控及遺傳病基因治療的重要技術之一[5]，但常用的陽離子脂質體轉染試劑對PC12細胞轉染效率低[1，6-8]。 本研究參照相關文獻[8-10]，通過在陽離子脂質體轉染過程中加入氯喹及亞精胺，同時調整陽離子脂質體轉染試劑與DNA用量的比例和轉染時間，實現提高PC12細胞轉染率，且未影響細胞的正常功能，為PC12細胞進行神經細胞基因功能及開發遺傳病治療方案等生物學研究提供了一種安全、廉價的新方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑：PC12 細胞（American Culture Collection），RPMI1640 培養基 （Sigma 公司），Lipofectamine2000（Invitrogen 公司），FuGENE HD （Roche 公司），PolyJet（Signagen Laboratoies 公 司 ），Lipofectamine LTX and Plus（Invitrogen 公司），pEGFP-N1（BD Biosciences 公司），氯喹（Sigma 公司），亞精胺（Sigma 公司），Ⅰ型牛膠原蛋白 （BD Biosciences公司），神經生長因子（NGF）（Peprotech 公司），噻唑藍（MTT）（Sigma 公司）。Axiovert 100 M倒置熒光顯微鏡 （Carl Zeiss公司），MetaMorph圖像分析處理軟件 （Molecular Devices公司），EL808 酶標儀（Bio-Tek Instrument公司）。

1.2 方法

1.2.1 PC12細胞培養 PC12細胞培養參照相關文獻[11-12]，細胞密度至 70%左右時進行傳代，傳至 2～3代的PC12細胞備用。

1.2.2 PC12細胞轉染 PC12細胞培養參照文獻[11]的方法，轉染的基本步驟[8]：將 4 μL Lipofectamine2000轉染試劑加入75 μL不含血清的新鮮RPMI 1640培養基中混勻，同時將1 μg質粒 pEGFP-N1加入150 μL不含血清的新鮮RPMI 1640培養基中孵育5 min后將兩溶液混勻，室溫靜置30 min，另將含（或不含）36 mmol/L氯喹、32 μmol/L亞精胺的無血清 RPMI 1640培養基75 μL加入上述陽離子脂質體/DNA復合物，移去細胞培養液后加入以上陽離子脂質體/DNA復合物，培養4 h后再棄去上述含陽離子脂質體/DNA復合物的細胞培養液，換成新鮮含5%胎牛血清、10%小牛血清的 RPMI 1640培養基，每室 300 μL。再培養48 h，然后在Axiovert 100 M倒置熒光顯微鏡，物鏡40×和目鏡10×放大倍數下拍照及計數分析。見圖1（封三）。

圖1 本法與Lipofectamine 2000法對PC12細胞增強綠色熒光蛋白表達比較

1.2.3 四甲基偶氮唑鹽（MTT）試驗 參照文獻[1]方法，用MTT試驗分別測定對照孔、在轉染過程中加（或不加）氯喹與亞精胺孔的PC12細胞活性。

1.2.4 PC12細胞神經軸突生長試驗 按文獻方法[11]，PC12細胞轉染48 h后，將細胞培養基換成含1%胎牛血清、含（或不含）100 ng/mL神經生長因子（NGF）的新鮮RPMI 1640培養基，培養5 d后，在倒置熒光顯微鏡物鏡40×和目鏡10×放大倍數下拍照及計數分析見圖2（封三）。

圖2 本法與Lipofectamine 2000法對PC12細胞神經軸突生長比較

1.2.5 轉染效率與神經軸突判定及統計 PC12細胞轉染48 h后，計數綠色熒光蛋白陽性的細胞占細胞總數的百分比即為轉染效率。參照文獻方法[11]，用Meta Morph圖像分析處理軟件計數并測量PC12細胞神經軸突的長度。

1.3 統計學方法

采用統計軟件SPSS 15.0對數據進行分析，正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩獨立樣本的計量資料采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DNA與Lipofectamine 2000的比例對 PC12細胞轉染效率的影響

當質粒 pEGFP-N1的用量為 1 μg時，Lipofectam ine2000用量相對較低時，PC12細胞轉染效率與Lipofectamine2000用量呈正相關，但隨著Lipofectam ine2000用量超過 4 μL，其毒副作用逐漸明顯，導致PC12細胞轉染效率逐步降低，且綠色熒光蛋白陽性細胞的死亡率明顯增加，本研究結果表明，對PC12細胞轉染，DNA∶Lipofectamine2000 用量比例應控制在 1∶4。

2.2 轉染時間對PC12細胞轉染效率的影響

當轉染時間分別為 1、2、4、8、24 h 時，PC12 細胞轉染率分別為 35.5%、37.9%、40.5%、40.3%及 38.6%。實驗結果表明，在未達到最佳轉染時間前，轉染效率隨轉染時間的延長而增加，4 h達到最大轉染效率，但在超過4 h后轉染時間后，轉染效率則會緩慢降低。

2.3 氯喹、亞精胺用量對PC12細胞轉染效率的影響

隨著氯喹、亞精胺加入濃度的增加，PC12細胞轉染效率也隨之增加，當氯喹、亞精胺加入終濃度分別增至 9 μmol/L和 8 μmol/L時，PC12細胞的轉染效率最高，轉染效率為40.5%。

2.4 氯喹、亞精胺對PC12細胞活性的影響

PC12細胞在轉染過程中加入終濃度為9 μmol/L氯喹與8 μmol/L亞精胺前、后MTT試驗吸光度（590 nm）分別為（0.466±0.042）與（0.451±0.038），差異無統計學意義（P＞0.05），表明PC12細胞的活性無影響。

2.5 氯喹、亞精胺對PC12細胞神經軸突生長的影響

轉染試劑Lipofectamine2000對轉染前后的PC12細胞及經NGF誘導后產生的神經軸突長度無影響。氯喹、亞精胺對PC12細胞的神經軸突生長數量與長度無影響；也間接表明在轉染過程中加入9 μmol/L氯喹及8 μmol/L亞精胺對PC12細胞的功能無影響。見表1。

表1 氯喹、亞精胺對PC12細胞神經軸突生長的影響（±s）

表1 氯喹、亞精胺對PC12細胞神經軸突生長的影響（±s）

方法 神經軸突數量（個） 神經軸突長度（μm）Lipofectamine 20002.41±0.1246.6±7.12本法2.48±0.1144.9±6.95 P值 ＞0.05＞0.05

2.6 本法與4種常用脂質體轉染試劑對PC12細胞轉染效率的比較

本文以pEGFP-N1為報告基因，用本法與常用的FuGENE、PolyJet、Lipofectamine LTX and Plus、Lipofectamine2000等4種脂質體轉染試劑對PC12細胞轉染效率進行了比較，結果：本法的PC12細胞轉染率為40.5%，其它四種脂質體轉染試劑對PC12細胞轉染效率分別為10.5%、8.6%、11.8%及15.3%。本法對PC12細胞的轉染效率明顯高于其他4種脂質體轉染法，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。見圖3。

圖3 本法與4種常用脂質體轉染試劑對PC12細胞轉染效率的比

3 討論

PC12細胞具有類似神經細胞的形態學改變及生理學特征而作為神經研究的模式細胞[1]。氯喹、亞精胺能明顯提高PC12細胞的轉染效率，且不影響PC12細胞的活性與正常功能，與文獻報道一致[1，8]。

氯喹是一種疏水性的弱堿，在PC12細胞轉染過程中能進入細胞吞噬溶酶體，在酸性環境下被質子化，隨著質子化的氯喹在吞噬溶酶體的累積，吞噬溶酶體開始腫脹，其包膜穩定性破壞，導致陽離子脂質體/DNA復合物釋放入細胞漿，同時，氯喹抑制吞噬溶酶體酸化與成熟，阻止陽離子脂質體/DNA復合物在溶酶體中的降解[8-9]，轉染過程中氯喹能提高PC12細胞轉染效率與上述氯喹的作用機制有關。亞精胺是一種多胺類制劑能通過增強DNA的復制與轉錄作用來提高PC12細胞轉染效率，同時能增強報告基因的表達強度[8]。

當 DNA：Lipofectamine2000 比 小 于 1∶4 時 ，Lipofectamine2000用量相對過多，N∶P比增加，陽離子脂質體/DNA復合物表面所帶的凈正電荷增多，PC12轉染效率也隨之增加[6]，但對 PC12細胞毒性作用也隨之增強，這與部分結合的Lipofectamine從陽離子脂質體/DNA復合物中分離，引起Lipofectamine內化而損傷細胞或破壞帶負電荷的細胞膜而影響PC12細胞的狀態，PC12細胞轉染效率與細胞活性也會降低[1]，及時更換RPMI1640培養基可以減少其毒性作用。

本文得到美國伊利諾斯州立大學芝加哥分校醫學院Beatrice Y.J.T.Yue教授指導，特此致謝！

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