糖尿病大鼠肺臟微循環(huán)通透性的變化及其意義

彭麗媛 王海瀾 翟芳龍 謝再明 王明君

1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬深圳市龍崗中心醫(yī)院，廣東深圳 518116；2.廣東省深圳市兒童醫(yī)院，廣東深圳 518000

糖尿病的患病率日益增加，它可使心血管、腎、視網(wǎng)膜、神經(jīng)等全身多個(gè)組織器官的結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生變化，由于它的致殘、致死性并發(fā)癥，目前已成為全球最關(guān)注的健康問題之一。20世紀(jì)70年代，Yeh等[1]首次提出肺臟可能是糖尿病的靶器官之一。糖尿病引起肺臟損害的假設(shè)在之后的國內(nèi)外研究中得到了肯定[2-3]，并且也越來越受到人們的重視。然而到目前為止，糖尿病引起肺功能損害的原因仍未完全明確。糖尿病對心血管、腎、視網(wǎng)膜、神經(jīng)等組織器官損害的基礎(chǔ)病變是糖尿病微血管病變，而肺組織存在著豐富的結(jié)締組織和血管系統(tǒng)，因此肺部微血管改變亦是糖尿病肺臟損害的病理基礎(chǔ)，故而設(shè)計(jì)了本課題，旨在為臨床提供糖尿病肺病的形態(tài)學(xué)依據(jù)，也為臨床上預(yù)防和治療糖尿病肺病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

選用健康雄性SD大鼠，體重200～240 g，平均（220±20）g，共72只，購于廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，動(dòng)物房采用晝夜交替，時(shí)間為12 h/12 h，保證室內(nèi)溫度（22±2）℃，嚴(yán)格遵照遵義醫(yī)學(xué)院的實(shí)驗(yàn)室管理制度要求。

1.2 藥品與儀器

鏈脲菌素（STZ）：美國 Sigma 公司，cas 18883-66-4，由上海寶曼生物公司提供；多聚甲醛、伊文思藍(lán)（E vans blue，EB）、甲酰胺均由上海寶曼生物公司提供。血糖儀及試紙、電子天平、平頭針、頭皮針、輸液架、自動(dòng)脫水機(jī)、自動(dòng)包埋機(jī)、離心機(jī)、石蠟切片機(jī)、恒溫水浴箱、烤箱、722分光光度計(jì)、熒光顯微鏡、大鼠固定器。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠模型的制備

健康雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食不禁水12 h，以65 mg/kg的劑量經(jīng)腹腔一次性注入新鮮配制的STZ溶液來制備糖尿病模型。72 h后，采取尾靜脈取血測血糖，血糖>16.7 mmol/L則入選為糖尿病模型。正常組的大鼠則腹腔內(nèi)注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。成模后大鼠給予自由飲食，不用任何藥物干預(yù)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組

SD大鼠中隨機(jī)選取12只作為正常組，腹腔注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；為防止大鼠造模失敗及實(shí)驗(yàn)過程中死亡而造成的數(shù)據(jù)缺失，實(shí)驗(yàn)組大鼠的實(shí)際數(shù)量為67只，將它們?nèi)吭炷：筇蕹炷２怀晒Φ拇笫螅炷３晒Φ拇笫髣t繼續(xù)飼養(yǎng)，在0、2、4、8、12周時(shí)間點(diǎn)，分別隨機(jī)選取12只作為該組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。各個(gè)實(shí)驗(yàn)組再隨機(jī)分為兩個(gè)區(qū)組，區(qū)組1的大鼠行心臟灌注，取下肺組織稱其干濕重；區(qū)組2大鼠則尾靜脈注入伊文思藍(lán)，循環(huán)1 h后行心臟灌注，再在分光光度計(jì)下測肺組織的OD值、制作石蠟切片后在熒光顯微鏡下觀察其熒光量。

1.3.3 干濕重法測肺臟組織的含水量

麻醉成功后，將大鼠仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺上，心臟灌注生理鹽水直至右心房流出液呈無色、肺臟變白、肝臟和腎臟變裸色、可視血管均呈白色為止，再灌注室溫4%多聚甲醛60 mL，直至大鼠身體變硬為止。取下肺組織，稱其濕重。再置于58℃烘箱中烘烤72 h至恒重，稱其干重。按Elliot公式計(jì)算每毫克肺組織的含水量：肺組織含水量=（濕重－干重）/濕重×100%，用組織含水量的差異來表示肺微血管通透性的變化。

1.3.4 伊文思藍(lán)灌注法測肺組織微血管的通透性

1.3.4.1 肺組織EB含量的測定

1.3.4.1.1繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 取1mg EB置于EP管中，加甲酰胺至10 mL，混勻后從中取出0.8 mL置于EP管中，再加甲酰胺至10 mL，此作為第1管，此時(shí)其濃度為8 μg/mL；從第1管中取5 mL，加入甲酰胺至10 mL，作為第2管，其濃度為4 μg/mL；再從第2管中取5 mL加入甲酰胺至10 mL，作為第3管，濃度為2 μg/mL……照此類推，共9管。將各管液體置于50℃水浴箱48 h后，以甲酰胺作為空白對照溶液，用722 N可見分光光度計(jì)在620 nm處測定各管溶液的吸光度 （即OD值），從而計(jì)算出回歸方程：Y=22.938X-0.1066，（R2=0.999）。 見圖1。

圖1 EB標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.4.1.2 EB含量的測量 參照相關(guān)文獻(xiàn)方法[4]，大鼠經(jīng)尾靜脈以1.5 mL/kg的濃度注入3%EB溶液，循環(huán)1 h后，麻醉、心臟灌注，取下左肺組織，稱重，置入3 mL甲酰胺溶液中，在50℃恒溫水浴箱中孵育48 h以使肺組織中的伊文思藍(lán)充分溶解在甲酰胺中，再以4000 r/min的速度離心20 min。取上清液，722分光光度計(jì)下測肺組織的OD值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出每份肺組織的EB濃度。再將它與質(zhì)量相比，可得每克肺組織的 EB量，即：每克肺組織 EB量（μg/g）=EB濃度（μg/mL）×3 mL/重量（g）。

1.3.4.2 石蠟熒光

如前所述，參照文獻(xiàn)方法[5]，尾靜脈注入 EB循環(huán)1 h后，麻醉大鼠，行心臟灌注，取下右肺組織后置于4%多聚甲醛溶液中固定12 h，自動(dòng)脫水機(jī)脫水并自動(dòng)包埋機(jī)包埋后再制成石蠟病理切片（防脫玻片），烤片2.5 h，置梯度酒精脫蠟、水化，直接甘油封片，立即在熒光顯微鏡綠色激發(fā)光下觀察EB在肺組織中的分布。相同曝光條件下，拍照記錄。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病模型制備的結(jié)果

對67只大鼠進(jìn)行造模，其中1只造模不成功予以剔除，在飼養(yǎng)過程中死亡大鼠數(shù)量為5只，分別是在造模后 3 d（1 只）、2 周（2 只）、8 周（1 只）、12 周（1只）。實(shí)驗(yàn)過程中觀察發(fā)現(xiàn)：正常大鼠反應(yīng)靈敏、活動(dòng)靈活、毛發(fā)光澤，血糖水平為（5.93±1.58）mmol/L；而造模后的大鼠反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)少、毛發(fā)疏松，體重不增甚至下降，且隨著糖尿病病程的延長，上述癥狀逐漸加重，糖尿病組的血糖均＞16.7 mmol/L。

2.2 區(qū)組1的大鼠肺組織含水量的比較

根據(jù)Ellliot公式計(jì)算各組大鼠肺組織的含水量，結(jié)果顯示：與正常組比較，0周組、2周組糖尿病大鼠肺組織的干濕重稍有增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而4周組、8周組和12周組糖尿病大鼠出現(xiàn)了組織干濕重明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠肺組織含水量測定結(jié)果（g，±s）

表1 各組大鼠肺組織含水量測定結(jié)果（g，±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05

組別 只數(shù) 干濕重正常組60.830±0.004 0周組60.839±0.005 2周組60.844±0.006 4周組60.869±0.006*8周組60.892±0.006*12周組60.916±0.024*

2.3 區(qū)組2的大鼠肺組織EB含量的測定

對各組大鼠肺組織EB的含量進(jìn)行測定，統(tǒng)計(jì)分析如下：與正常組相比較，0周組、2周組糖尿病大鼠肺組織EB含量稍有增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。從4周開始，糖尿病大鼠出現(xiàn)肺組織EB含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肺組織 EB含量測定結(jié)果（μg/g，±s）

表2 各組大鼠肺組織 EB含量測定結(jié)果（μg/g，±s）

注：與正常組比較，*P ＜ 0.05；EB：伊文思藍(lán)

組別 只數(shù) EB含量正常組67.793±0.342 0周組68.078±0.295 2周組68.562±0.630 4周組614.901±0.581*8周組618.855±3.153*12周組628.608±1.777*

2.4 區(qū)組2的大鼠肺組織的石蠟熒光

熒光顯微鏡下觀察各組大鼠的肺組織石蠟切片，可見正常大鼠的肺組織肺泡結(jié)構(gòu)正常；隨著病程的進(jìn)展，糖尿病組大鼠的肺泡結(jié)構(gòu)破壞、萎陷，肺泡腔縮小、數(shù)量增多且肺泡隔增厚；與正常相比較，0、2周組糖尿病大鼠的肺組織紅色熒光量較少，而4、8、12周糖尿病大鼠的肺組織則呈現(xiàn)較強(qiáng)的紅色熒光。見圖2（封三）。

圖2 肺組織EB灌注后的石蠟熒

3 討論

通過對比糖尿病大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的肺臟微血管通透性的變化，來研究肺臟微血管通透性改變與糖尿病肺病的關(guān)系，結(jié)果表明：糖尿病導(dǎo)致大鼠肺臟微血管通透性發(fā)生了變化。

微血管病變是糖尿病累及全身多個(gè)重要臟器的特征性病理變化[6-7]。肺臟是一個(gè)微血管極為豐富的器官。有研究顯示肺炎[8]、肺間質(zhì)纖維化[8]、慢性阻塞性肺疾病[9]、肺結(jié)核[10]等多種肺部疾病均與糖尿病病程和血糖控制不良有關(guān)。關(guān)于糖尿病肺病的發(fā)病機(jī)制，目前認(rèn)為與肺微血管病變、氧化應(yīng)激、炎癥、機(jī)體免疫力下降、自主神經(jīng)病變有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道糖尿病肺臟微血管病變病理改變主要為基底膜增厚、管腔阻塞，管壁硬化、透明性變，肺泡上皮增厚，肺泡隔透明性變、硬化，肺泡腔巨噬細(xì)胞和代謝產(chǎn)物積聚，肺泡-毛細(xì)血管彌散膜增厚，通氣/灌注失衡[2]。肺泡隔上皮細(xì)胞基板融合部以及肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞基板增厚，可能由糖尿病導(dǎo)致的微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及血管通透性增加而引起[11-12]。陳瑩瑩等[13]通過比較糖尿病C57/BL6小鼠與對照小鼠氣管切開后自主呼吸通氣4 h的肺微血管通透性變化，結(jié)果顯示糖尿病小鼠肺損傷可能與肺微血管通透性增加有關(guān)。而在本研究中，觀察了不同糖尿病病程的肺臟組織微血管通透性的變化，采用的反映肺臟微血管的通透性大小的指標(biāo)是現(xiàn)今應(yīng)用較廣泛的肺臟組織干濕重、EB法在分光光度計(jì)下測肺組織的OD值以及熒光顯微鏡下測肺組織的熒光量。其中，干濕重法是一個(gè)相對直觀的反應(yīng)組織含水量多少的指標(biāo)，它可間接反映微血管通透性的變化。而EB法測微血管通透性大小的原理是其與白蛋白的緊密結(jié)合，當(dāng)微血管通透性發(fā)生變化時(shí)，它可通過增大的細(xì)胞間隙到組織中，測量其組織中的含量即可分別定量和定性通透性大小。為了減少誤差，本研究采用心臟灌注以減少取材時(shí)血管內(nèi)EB含量對結(jié)果的影響。

本研究采用干濕重法、EB灌注法來反映肺微血管通透性的大小，結(jié)果表明，糖尿病大鼠4周時(shí)已可見明顯的微血管通透性的變化和肺泡結(jié)構(gòu)破壞、萎陷，肺泡腔縮小、數(shù)量增多和肺泡隔增厚，且隨著病程的進(jìn)展而不斷加重。其原因是糖尿病引起肺泡結(jié)構(gòu)變化、肺泡隔增厚和基質(zhì)增多，使肺泡氣體彌散距離及阻力增加，影響肺泡的氣體交換功能，從而引起組織缺氧的發(fā)生。長期處于高糖狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致肺泡內(nèi)血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)的改變，使肺部肺毛細(xì)血管壁的通透性增加，血漿及蛋白分子漏出量增加，組織蛋白使結(jié)締組織顯著增生，肺泡彈性降低，從而導(dǎo)致肺泡的通氣功能及彌散功能障礙。

通過觀察不同病程的糖尿病大鼠肺臟微血管通透性的變化，本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病導(dǎo)致了大鼠肺臟微血管通透性發(fā)生了變化。這不僅豐富了糖尿病肺病的發(fā)病機(jī)制的研究，同時(shí)也為其防治提供依據(jù)。當(dāng)然，改變肺通透性能否使糖尿病肺病得以改善，這仍有待進(jìn)一步的研究。

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