不同劑量辛伐他汀對慢性心房重構犬心房肌細胞內游離鈣離子濃度的影響

王 健 龐軍濤

1.山東省濰坊市人民醫院心內科，山東濰坊 261041；2.山東省濰坊市人民醫院重癥醫學科，山東濰坊 261041

心房重構概念的確立是對房顫（AF）病理生理認識的重大進步，為AF的預防和治療提供了新的思路和理論基礎。心房肌細胞內鈣超載是心房重構的重要分子機制。本研究利用快速心房起搏所致犬慢性心房重構模型觀察不同劑量辛伐他汀對慢性心房重構犬心房肌細胞內游離Ca2+濃度的影響，揭示他汀類藥物劑量與鈣超載抑制效應的關系，為他汀類藥物干預心房重構及抗心律失常作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

28只健康雜種犬均購自濰坊醫學院實驗中心，雌雄不限，體重8～11.5 kg。將其隨機分成4組：對照組，起搏組，干預1組，干預2組，每組各7只。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備 實驗動物用3%戊巴比妥鈉麻醉（30 mg/kg）。采用右側開胸法暴露右心房。將起搏電極縫于右心耳，電極導線由皮下竇道引至頸部傳出備用。術后第2天起，干預1組喂服默沙東制藥有限公司生產的辛伐他汀（批號 S1203）10 mg/d，干預 2組60 mg/d。術后第6天開始以480次/min的頻率通過備用電極快速起搏右心房（對照組只手術不起搏）。連續刺激6 d后，取各組犬右心房組織，測定心房肌細胞游離鈣濃度

1.2.2 測定游離鈣濃度 采用美國Sigma公司分裝的胰蛋白酶分解法獲得心房肌細胞懸液。以4℃預冷PBS液洗去所取犬右心耳組織血液，將組織剪碎，放入含有0.25%胰蛋白酶溶液的培養皿中，置于37℃溫箱中消化40 min。2000 r/min離心 15 min，棄去上清液，加入 D-Hank′s液，吹打，離心，棄去上清液，吹勻沉淀細胞，得到細胞懸液。取適量懸液于印孔載玻片上加入稀釋后的美國Biotium公司生產的Fluo-3/Am 20 μL，37℃避光孵育 30min。利用德國ZEISS公司生產的共聚焦顯微鏡掃描細胞內熒光強度。發射波長520 nm，激發波長488 nm。計算細胞內平均熒光強度，熒光強度越大，表示細胞內游離Ca2+濃度越高，反之則濃度越低。

1.3 統計學方法

采用SAS 9.1軟件進行統計分析統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較的SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

圖1a～d依次為對照組、起搏組、干預 1組、干預2組共聚焦顯微鏡下的單個心房肌細胞，綠色熒光代表細泡內游離Ca2+濃度（圖1，見封三）。起搏組犬心房肌細胞內游離Ca2+濃度高于對照組（P＜0.01）、干預1組（P ＜ 0.05）、干預 2組（P ＜ 0.01）明顯增加；干預 1組犬心房肌細胞內游離Ca2+濃度高于對照組（P＜0.05）和干預2組（P＜0.05）；對照組和干預 2組犬心房肌細胞內游離Ca2+濃度差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1、2。

表1 對照組與起搏組細胞內鈣離子濃度的比較（±s）

表1 對照組與起搏組細胞內鈣離子濃度的比較（±s）

組別 例數（只） 熒光強度 P值對照組7109.0±17.60＜0.01起搏組7162.0±18.40

表2 起搏組與干預組細胞內鈣離子濃度比較

圖1 各組細泡內游離鈣濃度（150×）（見內文第37頁）

3 討論

心房重構已是公認的是AF發生維持的病理生理基礎，這為臨床AF的藥物治療提供了新的目標——藥物預防心房重構。盡管具有很大的潛在價值，目前尚未找到安全有效的防治慢性心房重構的臨床用藥。尋找實用有效的臨床能夠防治慢性心房重構的藥物已成為AF防治中的迫切任務。

心房肌細胞內鈣超載是心房重構的重要分子機制[1]。Leistad等[2]在誘發 AF 25 min后，采用熒光法測定發現細胞內Ca2+含量增加1倍。快速心房刺激使收縮期相對延長，通過L型Ca2+通道進入細胞內的Ca2+增加，誘發肌漿網釋放 Ca2+，即 Ca2+誘發 Ca2+釋放，使細胞內Ca2+超負荷。Asuma等[3]通過電鏡研究了與時間相關的鈣分布的改變。結果提示鈣的超載會持續至少2周。Ica在調節人類心房頻率依賴性的心房肌動作電位時程（APD）和心房有效不應期（AERP）的變化中起重要作用，是參與心房電重構的主要離子通道[4]。快速心房刺激使收縮期相對延長，通過L型鈣通道進入細胞內的 Ca2+增加，誘發肌漿網釋放 Ca2+，即 Ca2+誘發Ca2+釋放，使細胞內鈣超載。細胞內Ca2+增加對L型Ca2+通道活性的負反饋作用使Ca2+電流減低，導致心房肌不應期和動作電位時間縮短及動作電位平臺相消失，因此，細胞內鈣超載可能是AF電重構的始動因素。鈣作為信號傳遞系統的重要組分也是引起AF時心房結構重構的主要因素之一。Brundel等[5]研究發現，AF時心房肌細胞細胞核、細胞槳和閏盤鈣水平增加，激活鈣激活蛋白酶Ⅰ。鈣激活蛋白酶的激活與心房ERP縮短，心房肌細胞結構的改變以及通道蛋白含量降低有關。L-型鈣通道蛋白質表達減少與心房收縮功能不全有關[6]。Lu等[7]通過研究證實犬AF模型的microRNA-328表達增高3.7倍，通過其靶基因CACNA1C和 CACNB1基因調控 L型 Ca2+通道的兩種亞基蛋白，并通過對L型Ca2+流產生影響達到縮短動作電位時程而參與AF的電重構。AF時鈣超載引起的心房收縮功能降低能導致心房肌被動延展，心房擴大進一步促進AF發生，引起惡性循環。

辛伐他汀可以影響細胞膜鈣電流和細胞內游離鈣[8-9]。該研究利用快速起搏制備的犬慢性心房重構模型近一步觀察辛伐他汀劑量與其抑制鈣超載作用之間的關系。結果證實辛伐他汀對快速心房起搏引起的心房肌細胞內鈣超載抑制作用的強弱，與藥物劑量相關。盡管常規劑量的辛伐他汀（干預1組）已經具備抑制心動過速心房肌細胞內鈣超載作用，進一步增加辛伐他汀劑量后，這種作用愈加明顯。結果顯示喂服辛伐他汀60 mg/d的實驗犬在連續快速刺激6 d后，其心房肌細胞內游離Ca2+濃度與對照組沒有明顯差異。提示他汀類藥物發揮充分抗心律失常作用可能需要超常規的劑量，所以其臨床的適用性尚需要更多的研究論證。

羥甲基戊二酰輔酶 A（HMGCoA）還原抑制劑作為能改善心血管病患者預后的調脂藥，除能有效降脂外，還具有多向效應，其原因很大程度上是因為羥甲基戊二酰輔酶還原抑制劑對細胞膜離子通道的影響。既往基礎研究證實辛伐他汀可抑制AngⅡ引起的細胞內瞬時鈣電流峰值，降低因AngⅡ引起的鈣電流增加[9]。而且大劑量的辛伐他汀可以抑制長期心動過速所致犬心房肌細胞ⅠCa α-亞單位蛋白的變化，抑制心動過速對AF的促發作用[10]。普伐他汀能夠逆轉快速起搏心房引起的電重構，可能的機制是普伐他汀能夠增強ⅠCa的作用進而延長動作電位時程[11]。本研究證實辛伐他汀可以抑制持續心動過速造成的細胞內鈣超載，大劑量使用比臨床常用劑量的效果更為明顯，這可能是其影響心房重構的分子機制之一。辛伐他汀對心房肌細胞內鈣超載的抑制作用可能是其臨床應用中降低AF發生率效應的分子基礎。另外他汀類藥物的抗炎抗氧化作用也是其抗心房重構作用的可能機制。

綜上所述，辛伐他汀是一種值得進一步探討的以抗心房重構為目標的AF治療藥物，期待更多的實驗和臨床研究確定其在AF防治中的效應和價值。

[1]Ausma J，Coker ML，Duimel H，et al.Changes in ultrastructural calcium distribution in goat atrial during atrial fibrillation[J].J Mol Cell Cardiol，2002，32：355-358.

[2]Leistad E，Verburg E，Christensen G.Cytosolic calcium overload，not atrial ischemia，ccounts for post-fibrillation atrial dysfunction[J].Circulation，1994，90（Suppl 1）：1-492.

[3]Ausma J，Dispersyn GD，Hans DH，et al.Changes in ul trastructural calcium distribution in goat atrial during atrial fibrillation[J].J Moll Cell Cardiol，1999，31：355.

[4]Van Gelder IC， Brundel BJ， Henning RH，et al.Alterations in gene expression of protein involved in the calcium handling in patients with atrial fibrillation[J].J Cardiovas Electrophysiol，1999，10（6）：947-953.

[5]Brundel BJ，Ausma J，Van Gelder IC，et al.Calpain activity is related to ion-channe1，structural and electrical remolding in human paroxysmal and persistent atrial fibrillation [J].Thesis University of Groningen，2003，12 （7）：132-133.

[6]Schotten UL，Ausma JN，Stellbrink CH，et al.Cellular mech anismsof depressed atrial contractility in patients with chronic atrial fibrillation[J].Circulation，2001，103：691-698.

[7]Lu Y，Zhang Y，Wang N，et al.MicroRNA-328 contributes to adverse electrical remodeling in atrial fibrillation[J].Circulation，2010，122（23）：2378-2387.

[8]Ng LL，Davies JE，Wojcikiewicz JH.3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a reductase inhibition modulates vasopressin-stimulated Ca2+response in rat A10 vascular smooth muscle cells[J].Circ Res，1994，74：173-181.

[9]Tesfamariam B，Frchlich BH，Gregg RE，et al.Diffe rential efects of pravastatin，simvastatin and atorvastatin on Ca2+release and vascular reactivity [J].Journal of Cardiovascular Pharmacology，1999，34：95-101.

[10]Shiroshita-takeshita A，Schram G，Lavoie J，et al.The effect of simvastatin and antioxidant vitamins on atrial fibrillation promotion by atrial-tachycardia remodeling in dogs[J].Circulation，2004，110：2313-2319.

[11]商麗華，胡大一，趙秀麗.普伐他汀對快速起搏心房肌離子通道的作用[J].中國醫藥導刊，2004，31（3）：192-194.