蒲芍前列腺炎膠囊乙醇提取最佳工藝研究

董政起 趙海婷，2 王韞哲，2 崔佳音，2 仲崇林

1.中國醫學科學院藥用植物研究所，北京 100193；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱 150040；3.吉林省中醫藥科學院，吉林長春 130021

慢性前列腺炎（chronic prostatitis，CP）是中青年男性的常見病、多發病，該病癥狀復雜，病程較長，且容易復發，嚴重影響患者的身心健康[1-2]。蒲芍前列腺炎膠囊系在研的新藥，是由土茯苓、蒲公英、牛膝、丹參、赤芍、紅花等十味中藥組成，具有清熱利濕，活血通淋之功效，用于慢性前列腺炎（屬于濕熱下注證者）[3-4]。該制劑是治療前列腺疾病的師傳經驗秘方，經30多年臨床實踐，吸收現代醫學新成果，不斷總結與改進，形成被臨床許多病例驗證取得滿意療效的復方制劑。

在蒲芍前列腺炎膠囊中，丹參、赤芍和紅花需要乙醇提取脂溶性有效成分，且丹參及赤芍的用藥量在本方中最大，是該藥處方中的主藥。為此需要對乙醇提取技術條件進行優選，以提高提取效率，最大程度獲取丹參及赤芍的有效成分，發揮蒲芍前列腺炎膠囊的藥效。在現有的研究中[5-6]，通常只對丹參或赤芍的乙醇提取工藝以各自的主要成分為指標進行單獨考察，所優化的條件不能滿足蒲芍前列腺炎膠囊的要求。因此，本研究采用正交設計試驗法，以丹參酮ⅡA和芍藥苷提得量為指標，綜合考慮來選擇蒲芍前列腺炎膠囊的最佳提取工藝[7-10]，為生產提供科學依據報道如下：

1 材料與方法

1.1 儀器

日本島津LC-9A高效液相色譜儀，SPD-6AV紫外檢測器，N2010色譜數據工作站（浙江大學智能信息工程研究所），分析天平AL104（梅特勒托利多儀器有限公司）；回流提取裝置（天津玻璃儀器廠）；旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥

所用藥材均購于安徽亳州藥材市場；丹參酮ⅡA和芍藥苷對照品由中國生物制品檢定所提供，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 工藝條件的選擇

本研究確定了影響提取效果的四個因素，即A：所用乙醇濃度；B：每次加乙醇量；C：每次提取時間；D：提取次數，并結合實際情況，本研究為每個因素確定了三個水平，見表1。筆者應用正交試驗以丹參酮ⅡA提得量和芍藥苷提得量為指標，按L9（3）4正交表進行試驗。以處方量1/4為一份樣品（赤芍30 g、丹參50 g、紅花20 g），加乙醇回流提取，提取液減壓回收乙醇，濃縮液轉移至100 mL的量瓶中，甲醇定容，分別測定丹參酮ⅡA和芍藥苷含量。

表1 考察因素水平表

2.2 含量測定

2.2.1 丹參酮ⅡA含量測定方法

2.2.1.1 丹參酮ⅡA含量測定供試品液的制備 精密量取上述各濃縮液1 mL置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.1.2 丹參酮ⅡA含量測定對照品溶液的制備 精密稱取丹參酮ⅡA對照品5 mg，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻；精密量取2 mL，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得（每1毫升中含丹參酮ⅡA 16.1 μg）。

2.2.1.3 丹參酮ⅡA含量測定方法學考察 ①色譜條件：用十八烷基硅烷鍵硅膠為填充劑，甲醇-水（73∶27）為流動相，檢測波長為270 nm。理論板數按丹參酮ⅡA峰計算，應不低于4000。②線性關系：分別精密吸取4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μL，注入高效液相色譜儀，按上述條件測定，以峰面積積分值為縱坐標，丹參酮ⅡA的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=-797 026.50+46 075 057.45X，r=0.9997，線性范圍：0.0644～0.322 μg。 ③精密度試驗：分別配制高、中、低（6.44、0.322、0.0644 μg/mL）3 種濃度的丹參酮ⅡA 樣品，按上述色譜條件分別于同一天內測定3次，連續測定3 d。日內精密度及日間精密度各組峰面積相對標準偏差（RSD）均小于2%。④重復性試驗：取同一批次樣品1 mL，共6份，按上述供試品溶液的制備及色譜條件測定，計算平均含量的RSD為1.9%。⑤加樣回收率試驗：精密稱定已知含量的供試品6份，每份1 mL，置50 ml具塞棕色錐形瓶中，分別加入丹參酮ⅡA對照品溶液適量，按上述色譜條件分別測定，計算加樣回收率。結果顯示：6組樣品的加樣回收率分別為99.32%、100.42%、98.87%、99.63%、101.13%、97.88%，RSD均小于2%。⑥穩定性試驗：取濃度為0.322 μg/mL的丹參酮ⅡA 樣品室溫放置 0、2、4、6、8、12 h，按上述條件進行測定，結果顯示：丹參酮ⅡA濃度在12 h內濃度無明顯變化，穩定性好，RSD小于2%。

2.2.1.4 丹參酮ⅡA樣品含量測定 精密吸取供試品液、對照品溶液10 μL進樣，注入液相色譜儀，測定峰面積，以外標法計算，即得。

2.2.2 芍藥苷含量測定方法的建立

2.2.2.1 芍藥苷含量測定供試品液制備 精密量取上述各濃縮液1.5 mL置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液10 mL，至10 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2.2 芍藥苷含量測定對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷對照品適量，加甲醇制成每毫升中含芍藥苷0.193 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2.3 芍藥苷含量測定方法學考察 ①色譜條件：用十八烷基硅烷健合硅膠為填充劑；甲醇-水（35∶65）為流動相；檢測波長為230 nm；流速1.0 mL/min。理論板數以芍藥苷峰（C23H28O11）計算應不低于3000。②線性關系：分別精密吸取 2、4、6、8、10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述條件測定，以峰面積積分值為縱坐標，芍藥苷的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程回 歸 方 程 ：Y ＝ -35 241.360＋1 349 289.119X，r=0.9999，線性范圍：0.386～1.930 μg。 ③精密度試驗：分別配制高、中、低（38.6、1.93、0.386 μg/mL）3 種濃度的芍藥苷樣品，按上述色譜條件分別于同一天內測定3次，連續測定3 d。日內精密度及日間精密度各組峰面積相對標準偏差RSD均小于2%。④重復性試驗：取同一批次樣品1.5 mL，共6份，按上述供試品溶液的制備及色譜條件，測定，計算含量。結果顯示，平均含量的RSD為1.1%。⑤加樣回收率試驗：精密稱定已知含量的供試品6份，每份 1.5 mL，置50 mL具塞錐形瓶中，分別加入芍藥苷對照品溶液適量，按上述色譜條件分別測定，計算加樣回收率。結果顯示：6組樣品的加樣回收率分別為98.82%、97.45%、100.87%、100.15%、98.35%和99.92%，RSD均小于2%。⑥穩定性試驗：取濃度為1.93 μg/mL的芍藥苷樣品室溫放置 0、2、4、6、8 和 12 h，按上述條件進行測定，結果顯示：芍藥苷濃度在12 h內濃度無明顯變化，穩定性好，RSD小于1%。

2.2.2.4 芍藥苷樣品含量測定 精密吸取供試品液、對照品溶液10 μL進樣，注入液相色譜儀，測定峰面積，以外標法計算，即得。

2.3 方差分析結果

方差分析結果表明：影響丹參酮ⅡA得量的主要因素依次為 B（乙醇用量）、A（乙醇濃度）、D（提取次數）、C（提取時間）；影響芍藥苷得量的主要因素依次為 D（提取次數）、A（乙醇濃度）、B（乙醇用量）、C（提取時間）。綜合上述兩項試驗結果并考慮生產成本因素，確定為A1B1C3D1，即80%乙醇加熱回流提取3次，每次1.0 h，每次加醇量分別為6倍，此為蒲芍前列腺炎膠囊的最佳乙醇提取工藝。丹參酮ⅡA和芍藥苷含量及方差分析結果見表2～5。

表2 正交試驗表及試驗結果（以丹參酮ⅡA為指標）

表3 方差分析

表4 正交試驗結果（以芍藥苷為指標）

表5 方差分析

3 討論

蒲芍前列腺炎膠囊主要由活血化瘀藥味組成，已有研究報道丹參、赤芍、紅花有改善微循環、減輕炎性反應、抑制結締組織增生作用，同時也有免疫調節作用[11]。此外，丹參酮ⅡA和芍藥苷作為單體化合物，也被證明具有抑制炎性免疫反應作用，可抑制淋巴細胞和單核細胞釋放類似的生長因子，從而減少了層粘連蛋白合成，促使前列腺炎癥減輕，纖維化程度減弱[12-13]。因此筆者選擇丹參酮ⅡA和芍藥苷為乙醇提取工藝優化的指標性成分是有一定科學依據的。丹參酮ⅡA和芍藥苷不但是本方中君藥的主要成分，也是本方發揮藥理作用的關鍵有效成分。

丹參酮ⅡA、芍藥苷的含量測定方法，本研究在參照《中國藥典》2010年版[9]規定及相關文獻[14-15]的基礎上，優化出符合本提取工藝的高效液相色譜條件。該方法簡便、準確、專屬性強，也可用于該制劑的質量控制。

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