一種黑曲霉斜面培養基的優化方法

柴敏

摘 要：通過一系列實驗，優化了黑曲霉Co827的斜面培養基配比。優化后的斜面培養基為3.5°Be～3.6°Be麥芽汁培養基。采用優化后的培養基，單菌落孢子數達到167.2×105左右，產孢子能力提高了15.07%，通過搖瓶驗證，產酸達到14.40%，提高了3%左右。

關鍵詞：黑曲霉Co827 斜面培養基 麥芽汁 優化

中圖分類號：TQ925 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2014）08（c）-0231-02

Abstract：A series of experiments is carried out in the study to optimize components of the Agarslantculture Medium for Aspergillus niger Co827.The optimal Agarslantculture Medium contains 3.5°Be～3.6°Be malt extract. Spore number from single colony reaches 167.2×105，that is 15.07% more compared with original by using optimal Agarslantculture Medium.14.40% Citric Acid accumulated in shaking flask is 3% more compared with original by confirmatory flask-shaking fermentation.

Key Words：Aspergillus Niger Co827；Agarslantculture Medium；Malt Extract；Optimize

黑曲霉Co827是目前國內大多數檸檬酸廠家廣泛使用的菌種，該菌種尤其適合以木薯干、玉米等淀粉質原料的發酵[1，2]。該菌種的擴大培養普遍采用小試管斜面培養—大試管斜面培養—三角瓶培養—鋼瓶—種子罐五級培養方式，然后接入大發酵罐發酵。其中，斜面培養階段提供的是大量的孢子，此階段孢子著生的旺衰直接影響后續菌種活力乃至大罐發酵水平[3]。衡量孢子著生旺衰（行業內成之為活力）的指標是單菌落孢子數和可轉接大試管數，然后檢測搖瓶產酸酸度加以驗證。目前國內大部分采取清液發酵技術的廠家普遍采用的培養基是3.0°Be麥芽汁[4]或土豆汁培養基，部分廠家在培養基里還添加營養鹽。目前國內廠家黑曲霉Co827單菌落孢子數約在145×105～146×105，搖瓶酸度約14.0%左右。筆者在本實驗中利用顯微鏡觀察不同組分的斜面培養基上黑曲霉菌落形態，進而測得單菌落孢子數，找出最優配方和濃度，并在搖床上培養96 h測得搖瓶酸度進行驗證。

1 材料和方法

1.1 菌種

黑曲霉Co827，菌落生長較快，菌落凸起，邊緣整齊，菌落較小，帶皺折，培養4天孢子呈黑色。96 h搖瓶產酸14.0%。

1.2 培養基

1.2.1 平板培養基

（1）麥芽汁培養基：2.0°Be～6.0°Be麥芽汁，瓊脂1.7%，pH自然。

（2）麥芽汁營養鹽培養基：3.0°Be麥芽汁，MgSO4.7H2O 0.15%、K2HPO40.36%，（NH4）2SO4 0.2%，瓊脂1.7%，pH自然。

（3）土豆汁培養基（PDA）：土豆汁，葡萄糖2%，瓊脂1.7%，pH自然。

（4）土豆汁營養鹽培養基：土豆汁，葡萄糖2%，MgSO4.7H20 0.15%，K2HPO40.36%，（NH4）2SO4 0.2%，瓊脂1.7%，pH自然。

1.2.2 發酵搖瓶培養基

玉米粉液化液15%，玉米液化液清液85%，pH自然。

1.3 主要儀器及設備

超凈工作臺（安徽省航天凈化設備有限公司）。

血球計數板（上海市求精生化試劑儀器有限公司）。

恒溫培養箱（杭州藍天化學儀器廠）。

恒溫搖床（哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司）。

顯微鏡（上海光學儀器六廠）。

恒溫培養箱（上海齊欣科學儀器有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1平板培養方法

將菌懸液用玻璃珠打散后搖勻，用吸管取0.1 ml滴入制作好的不同培養基的培養皿中，35 ℃培養96 h。

1.4.2 搖瓶培養方法

250 ml三角瓶內裝有消好的搖瓶培養基40 ml，將菌種自平板挑入三角瓶中，放入搖床，35 ℃，300 r/min轉速下培養96 h。

1.5 平板上菌落孢子計數

取100 μl滅菌水沖洗孢子，吸出孢子菌懸液至于EP（eppendorf）管中，取1 μl滴于載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片，不要有氣泡，然后在血球計數上查數孢子。

1.6 搖瓶酸度測定[5]

取1 ml搖瓶發酵液，以酚酞作為指示劑，以0.1429～0.1430 mol/L NaOH溶液滴定至淡粉紅色，所消耗的NaOH毫升數即為搖瓶酸度。

2 結果與分析

2.1 最優培養基組分的確定

分別采用不同波美度的麥芽汁、麥芽汁營養鹽、土豆汁、土豆汁營養鹽作培養基，將黑曲霉生產菌種培養96 h，在顯微鏡下觀測菌落生長情況。采用不同培養基96 h菌落形態如圖1所示。

從圖1可以看出，3.0°Be麥芽汁培養基和4.0°Be麥芽汁培養基上菌落形態規整，顏色較深，邊緣清晰，長勢較為旺盛。

將每個培養基做三個平行樣品，測定小試管中每個各個菌落的孢子數，取平均值。然后，將小試管中菌落轉接進大試管。測定結果見表1。endprint

從表1可以看出，3.0°Be及4.0°Be麥芽汁培養基的單菌落長孢子數分別為148.3×105和127.3×105，且可轉接大試管數均為30。所以，可以初步判定3.0°Be～4.0°Be的麥芽汁培養基為較優培養基，最為適合Co827的生長。

2.2 最優培養基濃度的確定

為了進一步確定最優麥芽汁濃度，以0.1°Be為一濃度梯度，每一梯度培養基做三個平行樣，測定單菌落孢子數，然后將單菌落接入三角瓶進行搖瓶發酵（起始糖液總糖為14.9%），測定96 h搖瓶酸度和96 h還原糖值，取三個平行樣的平均值。測定結果如表2所示。

由表2可以看出，隨著麥芽汁濃度的升高，單菌落孢子數逐步上升，3.5°Be～3.6°Be時達到峰值，為167.2×105左右，此后逐步下降。因此可以結論，3.5°Be～3.6°Be為最優麥芽汁培養基濃度。

同時，從表2中可以看出，3.5°Be～ 3.6°Be時，14.40%左右的搖瓶產酸也為最高，而還原糖降低到0.50%～0.51%左右，說明糖酸轉化率也較高。這一點再次證實了孢子數越多，菌種活力越強，產酸能力越高[7]，證實了3.5°Be～3.6°Be為最優麥芽汁培養基濃度。

3 結論

采用3.5°Be～3.6°Be麥芽汁培養基，單菌落孢子數達到167.2×105左右，產酸為14.40%左右，相對于現生產上普遍使用的3.0°Be麥芽汁培養基，產孢子能力提高了15.07%，搖瓶產酸提高了3.1%左右，這對于提高后續菌種活力，提高產酸水平，降低檸檬酸的生產成本具有重要意義。

參考文獻

[1] 姚汝華.微生物工程工藝原理[M].廣州：華南理工大學出版社，1990：93-99.

[2] 孫榮，王艷，楊平平.檸檬酸發酵現狀及展望[J].中國調味品，2011，36（1）：90-91.

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[4] 中國科學院微生物所.菌種鑒定手冊[M].北京：科學出版社，1980：93-94.

[5] GB/T 8269-2006，檸檬酸[S].北京：中國標準出版社，2006.

[6] GB/T 5009.7-2008，食品中還原糖的測定[S].北京：中國標準出版社，2008.

[7] 儲炬，李友榮.現代工業發酵調控學[M].北京：化學工業出版社，2001：43-48.endprint

從表1可以看出，3.0°Be及4.0°Be麥芽汁培養基的單菌落長孢子數分別為148.3×105和127.3×105，且可轉接大試管數均為30。所以，可以初步判定3.0°Be～4.0°Be的麥芽汁培養基為較優培養基，最為適合Co827的生長。

2.2 最優培養基濃度的確定

為了進一步確定最優麥芽汁濃度，以0.1°Be為一濃度梯度，每一梯度培養基做三個平行樣，測定單菌落孢子數，然后將單菌落接入三角瓶進行搖瓶發酵（起始糖液總糖為14.9%），測定96 h搖瓶酸度和96 h還原糖值，取三個平行樣的平均值。測定結果如表2所示。

由表2可以看出，隨著麥芽汁濃度的升高，單菌落孢子數逐步上升，3.5°Be～3.6°Be時達到峰值，為167.2×105左右，此后逐步下降。因此可以結論，3.5°Be～3.6°Be為最優麥芽汁培養基濃度。

同時，從表2中可以看出，3.5°Be～ 3.6°Be時，14.40%左右的搖瓶產酸也為最高，而還原糖降低到0.50%～0.51%左右，說明糖酸轉化率也較高。這一點再次證實了孢子數越多，菌種活力越強，產酸能力越高[7]，證實了3.5°Be～3.6°Be為最優麥芽汁培養基濃度。

3 結論

采用3.5°Be～3.6°Be麥芽汁培養基，單菌落孢子數達到167.2×105左右，產酸為14.40%左右，相對于現生產上普遍使用的3.0°Be麥芽汁培養基，產孢子能力提高了15.07%，搖瓶產酸提高了3.1%左右，這對于提高后續菌種活力，提高產酸水平，降低檸檬酸的生產成本具有重要意義。

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[7] 儲炬，李友榮.現代工業發酵調控學[M].北京：化學工業出版社，2001：43-48.endprint

從表1可以看出，3.0°Be及4.0°Be麥芽汁培養基的單菌落長孢子數分別為148.3×105和127.3×105，且可轉接大試管數均為30。所以，可以初步判定3.0°Be～4.0°Be的麥芽汁培養基為較優培養基，最為適合Co827的生長。

2.2 最優培養基濃度的確定

為了進一步確定最優麥芽汁濃度，以0.1°Be為一濃度梯度，每一梯度培養基做三個平行樣，測定單菌落孢子數，然后將單菌落接入三角瓶進行搖瓶發酵（起始糖液總糖為14.9%），測定96 h搖瓶酸度和96 h還原糖值，取三個平行樣的平均值。測定結果如表2所示。

由表2可以看出，隨著麥芽汁濃度的升高，單菌落孢子數逐步上升，3.5°Be～3.6°Be時達到峰值，為167.2×105左右，此后逐步下降。因此可以結論，3.5°Be～3.6°Be為最優麥芽汁培養基濃度。

同時，從表2中可以看出，3.5°Be～ 3.6°Be時，14.40%左右的搖瓶產酸也為最高，而還原糖降低到0.50%～0.51%左右，說明糖酸轉化率也較高。這一點再次證實了孢子數越多，菌種活力越強，產酸能力越高[7]，證實了3.5°Be～3.6°Be為最優麥芽汁培養基濃度。

3 結論

采用3.5°Be～3.6°Be麥芽汁培養基，單菌落孢子數達到167.2×105左右，產酸為14.40%左右，相對于現生產上普遍使用的3.0°Be麥芽汁培養基，產孢子能力提高了15.07%，搖瓶產酸提高了3.1%左右，這對于提高后續菌種活力，提高產酸水平，降低檸檬酸的生產成本具有重要意義。

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