復方四季青軟膏的制備及質量控制

涂金蘭?蔡絢?尹航?楊信定?何雨?石白冰

[摘要]目的 鑒別復方四季青軟膏中各主藥的真偽；研究復方四季青軟膏的制備方法；建立復方四季青軟膏含量的控制方法。 方法 以薄層色譜法鑒別四季青葉、大黃、紫草；以紫外分光光度法測定紫草中左旋紫草素的含量。 結果 左旋紫草素的乙醇溶液在5.64～33.87μg/mL范圍內，A與C呈良好線性關系，r=0.9999（n=6），平均回收率為98.80%，RSD（%）=0.88（n=6）。 結論 該方法準確、簡便，重現線好，可用于復方四季青軟膏中紫草含量的控制。

[關鍵詞] 復方四季青軟膏；含量測定；左旋紫草素

[中圖分類號] R927 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2014）18-29-05

復方四季青軟膏（原藥名紫柄冬青藥膏）為我院20世紀70年代燒傷科長期使用的外用制劑，臨床用于治療燒、燙傷、止痛、生肌活血等 ，該制劑療效確切，用藥安全，長期使用，未發現毒副作用，藥材資源豐富，價格低廉。是我院沿用了多年的有效經驗方[1]。紫草是復方四季青軟膏中的君藥 ，紫草性味甘、咸寒，具有涼血活血，解毒透疹的功效。是其最主要的藥理作用[2]。主要成分為萘醌類色素和多糖類化合物。紫草具有涼血、活血、解毒透疹的功效、熱毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、瘡瘍、濕疹、水火燙傷。現代藥理學研究表明，紫草具有較好的抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗過敏、保肝降酶等作用，是一種藥用價值很高的植物[3]。

四季青為冬青科植物冬青（Ilie purpurea Hasr）的干燥葉，始載于唐《本草拾遺》（紫柄冬青即為四季青，為貴州習慣用名）。性涼，味苦、微澀。具有清熱解毒、涼血止血、收斂生肌等功效。臨床上主要用于肺炎、急性咽喉炎癥、痢疾、膽道感染、外治燒傷、

下肢潰瘍、皮炎、濕疹、手腳皸裂等。其主要成分有：酚酸類、三萜及三萜皂苷類、黃酮類、揮發油類以及鞣質等[4]。

大黃為蓼科多年生草本植物掌葉大黃、唐古特大黃或藥用大黃的干燥根及根莖。本品味苦、性寒，具有攻積滯、導濕熱、瀉火、涼血、祛瘀、解毒等功效[5]。大黃功效獨特，現代藥理學研究表明其具有導瀉、利膽、保肝、抗菌、抗病毒、抗炎、止血、降脂、抗腫瘤等多種生物活性。其中，瀉下作用是其最主要的藥理作用。已有研究表明：生大黃瀉下作用峻烈，經酒制后其苦寒瀉下作用稍緩；經酒蒸后，瀉下作用緩和，并能增強活血祛瘀之功。大黃炭瀉下作用極微，并具有涼血化瘀止血作用[6]。

復方四季青軟膏中諸藥配伍，協同增效，療效顯著，具有清熱解毒、消腫止痛、收斂生肌的功效。為控制其制劑質量，我們選擇紫草作為該制劑含量測定指標，參考中華人民共和國2010年版藥典及相關文獻，采用薄層色譜法鑒別了四季青、大黃、紫草等藥材[7]，并用紫外分光光度法 建立了復方四季青軟膏的質量控制方法[8-11]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 UV-2501型-紫外分光光度計（日本島津企業管理有限公司）、METTLER-AE240型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）、LX-02型100克多功能粉碎機（上海江信科技有限公司）、HS102600D型超聲波清洗機（天津奧泰儀器有限公司）、HH-4型數顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）、硅膠GF254薄層板（青島海洋化工有限公司）、硅膠G薄層板（自制）、以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠H薄層版（青島海洋化工）。

1.1.2 藥材 四季青（Ilicis Chinensis Folium，自采）、大黃（Radix et Rhizoma Rhei，貴州同濟堂制藥有限公司）、大黃（對照藥材，中國藥品生物制品檢定所，鑒別用）、紫草（Radix Arnebiae，貴州同濟堂制藥有限公司）、紫草（對照藥材，中國藥品生物制品檢定所，鑒別用）、金銀花（Flos Lonicerae Japonicae， 貴州同濟堂制藥有限公司）、延胡索（Rhizoma Corydacis， 貴州同濟堂制藥有限公司）、冰片（貴州同濟堂制藥有限公司）。

1.1.3 試劑 左旋紫草素對照品（0769-9903，中國藥品生物制品檢定所，含量測定用）、四季青對照品（長梗冬青苷，111868-201001中國藥品生物制品檢定所）、大黃對照品（大黃素，110756-200110大黃酚，110796-201017中國藥品生物制品檢定所）、黃凡士林（南昌白云藥業有限公司）、復方四季青軟膏由貴陽醫學院附屬醫院藥劑科制劑室提供；硅藻土（化學純，成都市科龍化工試劑廠）；其余試劑均為分析純；所用水均為純化水。

1.2 方法

1.2.1 處方 四季青葉100g，大黃80g， 紫草60g，金銀花40g，延胡索20g，冰片4g，黃凡士林1000g。

1.2.2 制法 先稱取200g黃凡士林加熱熔化，加紫草60g以文火煎1h，用4層紗布濾過，濾液與殘渣均留備用。再將800g的黃凡士林加熱熔化，加處方量的大黃、延胡索以文火煎至焦黃后加處方量的金銀花、四季青葉及上述紫草殘渣以文火煎1h，用4層紗布濾過，合并兩次濾液，稍冷后加入冰片4g，攪拌使其完全溶解，放冷，分裝，即得。

1.2.3 藥材鑒別 （1）四季青葉的定性鑒別。取本品粉末3g，加乙酸乙酯60mL，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇3mL溶解，作為供試品溶液。另取長梗東青苷對照品，加甲醇制成每1mL含1mg的甲醇溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，用毛細管分別吸取上述兩種溶液適量，分別點與同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（7∶1∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（254nm）下檢視，供試品色譜中，在于對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；噴以1%的香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。（2）大黃的定性鑒別。取本品粉末0.1g，加甲醇20mL，浸泡1h，濾過，取濾液5mL，蒸干，殘渣加水10mL溶解，再加鹽酸1mL加熱回流30min，立即冷卻，用乙醚分兩次振搖提取，每次20mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加三氯甲烷1mL使溶解，作為供試品溶液。另取大黃對照藥材0.1g，同法制成對照藥材溶液。再取大黃素對照品，加甲醇制成每1mL含1mg的甲醇溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，用毛細管吸取上述三種溶液適量，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠H薄層版上，以石油醚（30～60℃）-甲酸甲酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點，置氨蒸氣中熏后，斑點變為紅色。（3）紫草的定性鑒別。取本品粉末0.5g，加石油醚（60～90℃）20mL，超聲處理20min，濾過，濾液濃縮至1mL，作為供試品溶液。另取紫草對照藥材0.5g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法試驗，用毛細管吸取兩種溶液適量，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶5∶0.5∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的紫紅色斑點；再噴以10%的氫氧化鉀甲醇溶液，斑點均變為藍色。endprint

2 含量測定

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取（1/10萬天平）左旋紫草素對照品5.04mg，置50mL容量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度搖勻，作為對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

稱取本品5g，置小燒杯中，加硅藻土5g，攪勻后移至具塞錐形瓶中，加100mL乙醇，于50℃水浴中 ，超聲40min，放冷，靜置，濾過，精密取續濾液5mL至25mL量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 左旋紫草素對照品最大吸收波長的測定

取左旋紫草素對照品乙醇液，以乙醇為空白對照，在600～400nm波長范圍內掃描，左旋紫草素對照品在516nm處有最大吸收。見圖1。

2.4 樣品紫外吸收圖測定

取樣品5g， 按“供試品溶液的制備”項下操作，在UV-2501紫外分光光度計上于600～400nm波長處掃描，516nm處有最大吸收。見圖2。

2.5 缺紫草陰性樣品對照液干擾試驗

取缺紫草陰性樣品5g，按“供試品溶液的制備”項下同法操作在UV-2501紫外分光光度計上于800～400nm波長處掃描，缺紫草陰性對照液在516nm處基本無吸收，且吸收度值極低，可忽略不計。

2.6 線性關系的考察

精密吸取對照品溶液1.4、2.8、4.2、5.6、7.0、8.4mL置25mL量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，以等量的乙醇液為空白對照，于516nm波長處測定吸收度。測定結果見表1。以濃度為橫坐標，吸收度為縱坐標繪制標準曲線。經線性回歸，得回歸方程：y=23.157x+0.0017，r=0.9999，左旋紫草素在5.64～33.87μg/mL范圍內A與C呈良好線性關系。見圖4 。

圖4 左旋紫草素對照品標準曲線

2.7 樣品含量測定

稱取各樣品5g，按“供試品溶液的制備”項下同法操作，測定各樣品中左旋紫草素含量。

2.8 加樣回收率試驗

稱取四季青軟膏2.5g、左旋紫草素對照品4.03mg置小燒杯中，加硅藻土2.5g，攪勻后移至具塞錐形瓶中，加100mL乙醇，于50℃水浴中加熱 ，超聲40min，放冷，靜置，濾過，取續濾液5mL加乙醇定容至25mL量瓶中，測定吸收度，同法操作6次，計算其回收率。

3 結果

3.1 樣品含量測定

3批樣品的紫草素含量分別為0.0169mg/mL（20121105），0.0167mg/mL（20121106），0.0162mg/mL（20121112）。見表1。

3.2 加樣回收率試驗

平均回收率為98.8092%，RSD（%）=0.8849。見表2。

3.3 精密度試驗

取同一對照品溶液同法測定6次，結果RSD（%）=0.13%（n=6），表明儀器精密度良好。

3.4 重復性試驗

稱取同批（20121112）復方四季青油膏樣品6份各5g，分別按“供試品溶液的制備”項下同法操作，測定各樣品吸光度，計算其左旋紫草素含量，測定結果RSD（%）=2.2%（n=6），說明重復性良好。

3.5 穩定性試驗

取同一供試品溶液，分別在0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，UV-2501型-紫外分光光度計上測定其吸光度，測得值RSD（%）=1.4%（n=6），表明供試品溶液在3h內基本穩定。

4 討論

4.1 復方四季青軟膏的提取方法

采用油煎法，在提取方法的研究中發現，若采用傳統的一次提取法[12]，紫草的含量很低，而采用新的提取方法兩次提取法（第一次單獨用黃凡士林提取紫草，第二次將第一次留下的紫草殘渣與其余藥材再用黃凡士林提取一次），既不造成藥材浪費，而且紫草含量大大提升，可高出一次提取法的兩倍[13]。在復方四季青青軟膏提取中還發現，不同產地與不同批次的紫草，含量差異較大， 無論是藥材的剪碎還是在油煎的過程中，都對結果有著一定的影響。在整個試驗中均需要用同一產地同一批次的紫草，以提高結果準確度。

表1 樣品含量測定結果

批號 吸光度值 吸光度平均值 樣品百分含量（%）

20121105 0.393 0.401 0.388 0.394 0.16

20121106 0.387 0.384 0.393 0.388 0.16

20121112 0.381 0.372 0.381 0.378 0.16

表2 加樣回收率試驗結果

樣品號 樣品含量 加入量 測得量 回收率（%） 平均回收率（%） RSD（%）

1 4.5149 4.03 8.4700 98.2675

2 4.5150 4.03 8.4780 98.2676

3 4.5100 4.03 8.4700 98.2600 98.8092 0.8849

4 4.5120 4.03 8.4900 98.7651

5 4.5100 4.03 8.4950 98.7690

6 4.5130 4.03 8.5670 100.5025

4.2 供試品的處理方法

采用醇提法。因紫草主含萘醌色素類物質，難溶于水，易溶于乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯等有機溶劑。考慮到生產成本與實際生產情況，選擇乙醇作為溶劑對復方四季青軟膏進行處理。對于乙醇濃度及乙醇用量的選擇，因2010年版《中國藥典》一部中已明確指出用95%的乙醇提取進行藥材含量測定，說明其羥基萘醌總色素在95%的乙醇中溶解最好，故本實驗選用的是95%的乙醇對供試品進行處理。而乙醇的用量，經過試驗發現，100mL乙醇可以充分溶解5g樣品。本實驗采用的是100mL 95%的乙醇來處理供試品。樣品測定結果表明， 通過對樣品顏色的觀察發現，左旋紫草素含量高的成品顏色深紅， 而所測含量較低的成品顏色淺紫， 這可能與紫草原藥材的質量有關。endprint

4.3 測定方法的選擇

據有關文獻報道紫草含量測定可采用高效液相色譜法、薄層掃描測定法及紫外-可見分光光度法。本試驗采用的是紫外分光光度法來測定紫草的含量，結果試驗的重現性及回收率均較好。

5 結論

經供試品提取方法試驗考查， 用100mL 95%乙醇，超聲提取40min， 供試液穩定， 試驗的重現性及回收率均較好，且該方法簡便，準確，可用于復方四季青軟膏中紫草含量的控制。

[參考文獻]

[1] 貴州省藥品檢驗所.醫院藥物制劑[M].貴陽：貴州出版社，1979：346-347.

[2] 劉易蓉，周勇.復方紫青膏中藥的定性鑒別研究[J].貴州醫藥，2013，37（1）：64.

[3] 郭鑫，李治建.新疆紫草化學成分的初步研究[J].時珍國醫國藥，2012，23（4）：814.

[4] 張玉梅，李春華.中藥四季青的化學成分研究[J].吉林中醫藥，2010，30（3）：252.

[5] 張子，魏剛.大黃及其醇提液HPLC特征圖譜相關性研究[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（21）：69-73.

[6] 劉亮亮，隋峰.大黃炮制品各組分瀉下作用的比較研究[J].中國醫藥學雜志，2012，18（17）：161.

[7] 中國藥典委員會.中華人名共和國藥典（一部）[M].北京：化學工業出版，2010.

[8] 唐啟令，張巖，杜興.復方紫草油的質量標準研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2003，14（6）：407-408.

[9] 陳茂霞，張林輝.紫草膏的制備及質量控制[J].制劑技術，2008，17（19）：42-43.

[10] 王小春，劉敏.紫草含量測定方法的探討[J].藥物鑒定，2006，6（15）：20.

[11] 鄒桂欣，尤獻民.紫外分光光度法測定中藥復方制劑中紫草總萘醌的含量[J].時珍國醫國藥，2003，14 （4）： 212-213.

[12] 耿維鳳.復方紫柄冬青軟膏的制備與臨床應用[J].中國醫藥學雜志，2003，11（23）：701.

[13] 楊曉笛，盧峰，黃美充，等.中藥紫草有效成分的提取[J].汕頭大學學報，2002，17（4）：67-70.

（收稿日期：2014-06-26）endprint

4.3 測定方法的選擇

據有關文獻報道紫草含量測定可采用高效液相色譜法、薄層掃描測定法及紫外-可見分光光度法。本試驗采用的是紫外分光光度法來測定紫草的含量，結果試驗的重現性及回收率均較好。

5 結論

經供試品提取方法試驗考查， 用100mL 95%乙醇，超聲提取40min， 供試液穩定， 試驗的重現性及回收率均較好，且該方法簡便，準確，可用于復方四季青軟膏中紫草含量的控制。

[參考文獻]

[1] 貴州省藥品檢驗所.醫院藥物制劑[M].貴陽：貴州出版社，1979：346-347.

[2] 劉易蓉，周勇.復方紫青膏中藥的定性鑒別研究[J].貴州醫藥，2013，37（1）：64.

[3] 郭鑫，李治建.新疆紫草化學成分的初步研究[J].時珍國醫國藥，2012，23（4）：814.

[4] 張玉梅，李春華.中藥四季青的化學成分研究[J].吉林中醫藥，2010，30（3）：252.

[5] 張子，魏剛.大黃及其醇提液HPLC特征圖譜相關性研究[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（21）：69-73.

[6] 劉亮亮，隋峰.大黃炮制品各組分瀉下作用的比較研究[J].中國醫藥學雜志，2012，18（17）：161.

[7] 中國藥典委員會.中華人名共和國藥典（一部）[M].北京：化學工業出版，2010.

[8] 唐啟令，張巖，杜興.復方紫草油的質量標準研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2003，14（6）：407-408.

[9] 陳茂霞，張林輝.紫草膏的制備及質量控制[J].制劑技術，2008，17（19）：42-43.

[10] 王小春，劉敏.紫草含量測定方法的探討[J].藥物鑒定，2006，6（15）：20.

[11] 鄒桂欣，尤獻民.紫外分光光度法測定中藥復方制劑中紫草總萘醌的含量[J].時珍國醫國藥，2003，14 （4）： 212-213.

[12] 耿維鳳.復方紫柄冬青軟膏的制備與臨床應用[J].中國醫藥學雜志，2003，11（23）：701.

[13] 楊曉笛，盧峰，黃美充，等.中藥紫草有效成分的提取[J].汕頭大學學報，2002，17（4）：67-70.

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4.3 測定方法的選擇

據有關文獻報道紫草含量測定可采用高效液相色譜法、薄層掃描測定法及紫外-可見分光光度法。本試驗采用的是紫外分光光度法來測定紫草的含量，結果試驗的重現性及回收率均較好。

5 結論

經供試品提取方法試驗考查， 用100mL 95%乙醇，超聲提取40min， 供試液穩定， 試驗的重現性及回收率均較好，且該方法簡便，準確，可用于復方四季青軟膏中紫草含量的控制。

[參考文獻]

[1] 貴州省藥品檢驗所.醫院藥物制劑[M].貴陽：貴州出版社，1979：346-347.

[2] 劉易蓉，周勇.復方紫青膏中藥的定性鑒別研究[J].貴州醫藥，2013，37（1）：64.

[3] 郭鑫，李治建.新疆紫草化學成分的初步研究[J].時珍國醫國藥，2012，23（4）：814.

[4] 張玉梅，李春華.中藥四季青的化學成分研究[J].吉林中醫藥，2010，30（3）：252.

[5] 張子，魏剛.大黃及其醇提液HPLC特征圖譜相關性研究[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（21）：69-73.

[6] 劉亮亮，隋峰.大黃炮制品各組分瀉下作用的比較研究[J].中國醫藥學雜志，2012，18（17）：161.

[7] 中國藥典委員會.中華人名共和國藥典（一部）[M].北京：化學工業出版，2010.

[8] 唐啟令，張巖，杜興.復方紫草油的質量標準研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2003，14（6）：407-408.

[9] 陳茂霞，張林輝.紫草膏的制備及質量控制[J].制劑技術，2008，17（19）：42-43.

[10] 王小春，劉敏.紫草含量測定方法的探討[J].藥物鑒定，2006，6（15）：20.

[11] 鄒桂欣，尤獻民.紫外分光光度法測定中藥復方制劑中紫草總萘醌的含量[J].時珍國醫國藥，2003，14 （4）： 212-213.

[12] 耿維鳳.復方紫柄冬青軟膏的制備與臨床應用[J].中國醫藥學雜志，2003，11（23）：701.

[13] 楊曉笛，盧峰，黃美充，等.中藥紫草有效成分的提取[J].汕頭大學學報，2002，17（4）：67-70.

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